补阳还五汤对高脂血症模型大鼠FAK-PI3K-AKT信号通路的作用影响*

卞敬琦，张玉昆，冯月男，牛雯颖

(黑龙江中医药大学实验实训中心，哈尔滨 150040)

高脂血症是诱发动脉粥样硬化、血栓的主要因素，严重威胁人类健康。血脂异常可损伤血管壁内皮细胞，促使血小板黏附、聚集和释放，从而引起血小板活化。补阳还五汤具有抗动脉粥样硬化、改善血流动力学、降血脂、抗血小板活化等作用，至今已沿用百年，是治疗卒中之气虚血瘀证的名方。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路广泛调控细胞功能，有报道显示，抑制Class IA PI3K信号通路可明显降低小鼠游离脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)水平[1]，故本实验以黏附斑激酶(FAK)-PI3K-AKT信号通路为切入点，对补阳还五汤对高脂血症模型大鼠作用机制进行研究，以期探讨潜在作用靶点，为中医药治疗高脂血症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物

选取清洁级健康SD大鼠50只，雄性，体重(235.4±10.6)g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(黑)2013-001)。

1.1.2药品与试剂

补阳还五汤药物组成：黄芪120 g，归尾6 g，赤芍5 g，地龙3 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g；辛伐他汀片购自哈药集团三精明水药业有限公司(批号：201706001，规格：10 mg)；TC、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、TG试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号：182022、180671、187831)；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶快速制备试剂盒、Western洗涤液、SDS-PAGE电泳液(干粉)、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、电化学发光(ECL)液、FAK、Syk、磷酸化蛋白激酶B[p-AKT(Ser473)]、磷脂酰肌醇激酶β抗体(PI3Kp110β)、羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)、内参抗体均购自中国万类生物科技有限公司(货号：WLA019、WLA004、WLA007、WLA013、WLA025、WLA026、WLA005、WLA003、WL03550、WL02427、WLP001a、WL03380、WLA023、WL01845)；预染蛋白分子量标准购自加拿大富酶泰斯生物技术有限公司(货号：26616)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国默克公司(货号：IPVH00010)；牛血清清蛋白(BSA)购自白鲨生物科技(中国)有限公司(货号：BS043)；4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(PIP5K)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)均购自武汉三鹰生物技术有限公司(货号:13361-1-AP、55190-1-AP)；磷酸化蛋白激酶1/2/3抗体[p-AKT1/2/3(Thr308)]购自亲科生物(中国)公司(货号：AF3262)；脱脂奶粉购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司(货号：Q/NYLB 0039S)。

1.1.3仪器

WD-9405B水平摇床、DYY-7C电泳仪、DYCZ-40D转移槽购自北京六一生物科技有限公司；Proline微量移液器购自百得实验室(中国)有限公司；NW10LVF超纯水系统购自力康生物理疗科技控股有限公司；H-2050R超速冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ELX-800酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；DH36001B电热恒温培养箱购自天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验造模及动物分组、给药方法

将50只大鼠适应性喂养7 d后，10只大鼠喂食基础饲料(空白组)，40只大鼠喂食高脂饲料(基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.2%胆固醇+0.2%胆酸钠)，正常饮水、自由进食。于第4周开始检测动物血脂水平，确认高脂血症模型动物造模成功后，根据随机数字表法将40只高脂血症模型大鼠分为4组，即补阳还五汤高剂量组(高剂量组，生药14.0 g/kg)、补阳还五汤低剂量组(低剂量组，生药3.5 g/kg)、辛伐他汀对照组(对照组，0.004 g/kg)和模型组，每组10只。空白组继续伺以普通饲料，其他组继续高脂饲料喂养。各给药组灌服相应药物，空白组和模型组灌服等体积蒸馏水，每天1次，连续4周。

1.2.2检测指标

(1)血脂测定：腹主动脉取血，取枸橼酸钠抗凝血3 mL，3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆，按照TC、TG、LDL-C试剂盒说明书，利用全自动生化分析仪操作。(2)Western blot检测相关信号通路中相关蛋白：根据每个样本的质量和体积的不同加入不同体积的裂解样本，然后将其继续放置于冰上裂解5 min，离心(12 000 r/min，4 ℃，10 min)，弃上清液获得蛋白质抽提物，用5×Loading Buffer和磷酸盐缓冲液(PBS)稀释蛋白样品，在沸水浴中煮沸5 min，制成上样液备用。本次实验的上样体积20 μL，含30 μg蛋白。将蛋白样本进行电泳、转印、封闭后，加入对应的一抗FAK(1∶500)、Syk(1∶500)、PIP5K(1∶500)、PI3Kp110β(1∶500)、p-AKT(Ser473)(1∶500)、p-AKT1/2/3(Thr308)(1∶1 000)、ATGL(1∶1 000)孵育，用TBST洗膜，然后与对应的二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育45 min，洗膜。用ECL底物发光，用凝胶成像分析目标条带的吸光度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血脂水平比较

与空白组比较，模型组大鼠血浆TC、TG和LDL-C水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，高、低剂量组和对照组大鼠血浆TC、TG和LDL-C水平明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血脂水平比较

2.2 各组大鼠相关蛋白水平比较

与空白组比较，模型组中蛋白FAK、PIP5K、PI3Kp110β、p-AKT1/2/3(Thr308)、p-AKT(Ser473)、 ATGL均上调，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，低剂量组和对照组均抑制了该信号通路蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量组明显抑制蛋白FAK和ATGL的表达，差异有统计学意义(P<0.01)，对于其他蛋白表达也有抑制作用，但结果无统计学意义(P>0.05)，见表2、图1。

表2 各组大鼠蛋白的相对表达水平比较

图1 各组蛋白条带图

3 讨 论

高脂血症是一种脂质代谢紊乱性疾病，发病率逐年攀升，且大多数患者并无明显症状。有研究指出2010-2030年中国心血管患者将增加920万，而高脂血症是其发病的主要诱因[2]。他汀类药物是目前广泛使用的一线降脂药物，可有效降低LDL和TG水平，所以本研究使用辛托伐他汀作为对照药物。现代药理研究表明，补阳还五汤可明显降低高脂血症患者血脂水平、改善脂代谢紊乱状况[3]。补阳还五汤中黄芪含有的黄芪多糖具有抗氧化、免疫调节及降低血脂的作用[4]；当归中所含的阿魏酸能够抑制胆固醇的合成及脂质在血管中的沉积，从而起到抗动脉粥样硬化的作用[5]；赤芍提取物能有效调节早期糖尿病肾病大鼠脂代谢紊乱水平[6]；地龙中含有的活性肽类—地龙多肽可预防性降低血脂及肝脂水平，改善脂肪酸代谢异常[7]；并且中药具有不良反应少价格低廉等优点，作为降脂药物具有广泛的前景及应用市场。研究发现，PI3K-AKT广泛参与了高脂血症的形成和发展[8]，而抑制FAK蛋白的表达，能够降低动脉粥样硬化斑块的形成[9]，故本文采用高脂饲料喂养复制高脂血症模型大鼠，研究补阳还五汤对FAK-PI3K/AKT信号通路的影响。

TG是哺乳动物的主要能量储备，而ATGL是一种重要的水解脂肪限速酶，能够将TG水解为二酰甘油(DAG)和FFA[10-12]。本实验结果显示，高脂血症大鼠血浆中TG水平明显升高、ATGL的表达水平明显上调，说明高脂血症模型大鼠存在脂代谢异常状态，且体内有大量被水解的DAG，蓄积的DAG可以激活蛋白激酶C，促进整合蛋白αIIbβ3磷酸化[13-16]，继而进一步引起FAK的磷酸化。高脂血症形成过程中伴随着一系列复杂的细胞信号调节，而FAK在多个信号调节扮演着枢纽的角色，FAK磷酸化可导致细胞黏附和下游靶蛋白的活化，PI3K便是其中之一，PI3K包括p85和p110两个亚基。研究表明，PI3Kp110β抑制剂或PI3Kp110β有缺陷时，会影响血小板活化并阻止动脉血栓形成[17-20]。活化的PI3K催化肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)。其中，PIP5K可以产生PIP2，从而为PI3K提供更多的底物。AKT是PI3K下游的重要靶标激酶，PIP3可与AKT结合，将AKT从细胞质转移到细胞膜并促进Ser473和Thr308在其位点的磷酸化，从而使AKT完全激活。Thr308和Ser473的磷酸化是AKT激活的必要条件，只有激活的AKT才能启动PI3K/AKT信号传导途径，以促进下游级联反应继续传播并发挥生物学作用[21]。

综上所述，本研究从FAK-PI3K-AKT信号通路和对TG水解产生重要影响的水解酶ATGL两方面对高脂血症模型大鼠进行研究，结果显示，ATGL、FAK-PI3K-AKT通路相关蛋白在高脂血症大鼠体内呈高表达状态。补阳还五汤干预治疗后，高脂血症模型大鼠血脂水平明显降低。(1)补阳还五汤能下调ATGL蛋白表达，降低体内蓄积的DAG，阻止了FAK的磷酸化；(2)补阳还五汤低剂量组能直接降低FAK-PI3K-AKT通路上关键蛋白Thr308和Ser473的表达，从而抑制了FAK-PI3K/AKT信号通路的激活，降低了脂质形成。本研究内容较好地揭示了补阳还五汤防治高脂血症具有多途径、多靶点的综合作用，可为今后高脂血症临床用药提供新的思路和治疗依据。