奶牛乳房炎大肠杆菌的生化鉴定

贾文玉，贾晓峰，王英杰，雷雄伟

( 高台县罗城镇畜牧兽医工作站 ，甘肃 高台 734300)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检材料甘肃省张掖市高台县巷道镇殷家庄村六社三个养殖场(区)的129份奶样，经无菌采集，在甘肃省张掖市高台县动物疫病预防控制中心实验室分离、培养观察后获得的18份疑似大肠杆菌纯培养物。

1.1.2 生物化培养基及试剂培养基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、硝酸盐、尿素、枸橼酸、H2S,试 剂：Ehrlich氏试剂，高硫酸钾饱和溶液、甲基红试剂、VP试剂、硝酸盐试剂。

1.2 方法

1.2.1 培养基及试剂的配制 (1)糖类分解实验(葡萄糖、乳糖、蔗糖), 用量：各配100 mL。 配方：蛋白胨0.2 g、氯化钠0.5 g、磷酸氢二钾0.02 g琼脂0.3 g、蒸馏水、pH调至7.4。加入各种糖类各1 g及质量分数为1.6%的溴甲酚紫0.1 mL。121℃高压灭菌10 min。(2)吲哚实验,用量：100 mL, 配方：Dunham氏蛋白胨水溶液：蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、蒸馏水150 mL，pH调至7.6,高压灭菌，晾干后于4℃保存。 高硫酸钾饱和液 高硫酸钾2.65 g，溶解于50 mL蒸馏水中。(3)甲基红(MR)、VP实验, 用量：100 mL, 配方：葡萄糖蛋白胨水溶液：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸氢二钾0.5 g、蒸馏水150 mL,pH调至7.2～7.6, 乙液：氢氧化钾溶液(氢氧化钾40 g，蒸馏水150 mL)。装于棕色瓶中，于4～10℃保存(4)枸橼酸盐利用实验(西蒙氏枸橼酸盐), 用量：100 mL； 配方：称取现成的西蒙氏枸橼酸盐琼脂2.98 g，解热搅拌溶解于150 mL蒸馏水中，PH调至6.7～6.9，121℃高压灭菌15 min制成斜面长5～6 cm，底长3～4 cm的斜面培养基，备用。(5)硫化氢试验(三糖铁培养基), 用量：100mL； 配方：称取现成的三糖铁琼脂(TSI)6.55 g，加热溶解于150 mL蒸馏水中，煮沸3 min，分装于16*150 mm试管，PH调至7.3～7.5，121℃高压灭菌25 min制成斜面长5～7 cm，底长4～5 cm的斜面培养基，备用。 (6)动力学检测(半固体培养基), 用量：100 mL； 配方：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、磷酸氢二钾0.1 g、琼脂0.6 g，调pH至7.6，高压灭菌。

1.2.2 生化试验 (1)吲哚试验 取纯培养物接种于Dunham氏蛋白胨水溶液，37℃培养2～3d，脱脂棉上加Ehrlich与高硫酸钾饱和溶液，置于被检试管上，离液面1.5 cm，水溶煮沸为止，观察结果。 判定标准：脱脂棉上出现红色者为阳性。(2)枸橼酸盐利用试验 取纯培养物接种于枸橼酸培养基内，37℃培养18～36 h，观察结果。 判定标准：培养基转为黑色者为阳性，以“+”表示。(3)硫化氢试验取纯培养物接种于半固体培养基，37℃培养18～36 h，观察结果。 判定标准：由运动视为细菌，可由穿刺线向四周扩散生长，使周围的培养基变成浑浊即为阳性；无运动力的细菌仅能延穿刺线生长，周围的培养基仍然保持澄清即为阴性。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 动力学检测 经细菌动力学检测结果显示，18株菌株中，其中大多数可由穿刺线向四周扩散生长，使周围培养基变成混浊，即为阳性；而仅有少数能延穿刺线生长，周围的培养基任然保持澄清，即为阴性。

2.1.2 生化鉴定由上表1可知，18菌株经生化鉴定后，其中只有5株为大肠杆菌，分别为W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12，其中5株大肠杆菌在葡萄糖及乳糖培养基上均产酸产气，在蔗糖培养基上仅产酸或呈阴性，吲哚、MR及硝酸盐培养基上呈阳性，在VP、尿素、枸橼酸及硫化氢培养基上既不产酸也不产气，即为阴性。

表1 乳牛乳房炎大肠杆菌的生化鉴定结果

2.2 分析

对比大肠杆菌科中与兽医学有关的主要属的生化鉴定表，细菌的动力学检测大多数检测为阳性，少数为阴性，判定为肠杆菌属。

从奶牛乳房炎大肠杆菌生化鉴定的结果来看，W1Y49、W1Y20、W1Y20、W1Y14、W2L12符合大肠杆菌生化鉴定结果，故确定为大肠杆菌。

3 讨论

通过对乳样经无菌采集、分离培养、观察后获得的18份疑似大肠杆菌纯培养物，经过生化试验即将该纯培养物接种到生化培养基上，37℃培养，来鉴定大肠杆菌。细菌的生化实验方法有很多种，本实验中采取了葡萄糖、乳糖、蔗糖、吲哚、MR、VP、等十种生化培养基，将23株疑似大肠杆菌纯培养物分别接种于该十种生化培养基上，经培养基观察其实验结果，以1984年版《伯吉氏细菌鉴定手册》和1994年版《伯吉氏细菌鉴定手册》第9版中相应科、属下的各个种的生理生化指标为依据，结果证明只有其中的5株(W1Y49、W1Y20、W1Y14、W2L12)为大肠杆菌，其余的均不是。本实验还将23株疑似大肠杆菌纯培养物穿刺培养到半固体培养基上，通过观察细菌的运动力，也做出了初步的判断。