患病龙虾病原检测及药敏试验

○姚方艳

2020年，我县归仁镇3个塘口的养殖户龙虾塘口出现了死亡的现象，病虾主要表现为头胸甲易剥离、螯肢及附肢无力、反应迟钝、应激能力较弱，在头胸甲部位常出现白斑。笔者通过对病虾肝胰腺的细菌分离及鉴定和对虾鳃的白斑病毒的提取及PCR法分子检测技术来探讨引起小龙虾发病的原因。

1 方法

1.1 病原菌的分离、鉴定及药敏试验

（1）病原菌的分离：用灭菌棉签蘸取小龙虾肝胰腺，均匀涂于普通营养琼脂培养基上和TCBS培养基上，分别置于28℃、37℃恒温培养18-24h后，观察菌落形态，并挑取可疑单个菌落划线接种在营养琼脂平板和3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上，分别置于28℃、37℃恒温培养18-24h。

（2）细菌的鉴定：把分离出的细菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

（3）药敏试验：挑取单菌落于5mL生理盐水中制成0.5麦氏单位的菌悬液（A管），从中吸取0.1mL，加入到10mL无菌生理盐水中混匀（B管）。利用微量移液器吸取B液，加入药敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分别测定细菌分离株对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠共7种常见药物的敏感程度。盖好试剂板，置于35℃培养箱培养18-24h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度。

1.2 WSSV核酸提取及检测：

从病虾中取约100 mg鳃组织，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒的说明进行DNA提取，对WSSV DNA样本采用《GB/T 28630.2-2012白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分套式PCR检测法》为标准进行检测。PCR扩增体系总量为50μL，分别为：25μL Mix Taq酶（Takara），18μL 无菌水，1 μL 正向引物，1 μL反向引物，5 μL模板。PCR产物通过用50×TAE电泳缓冲液配制的1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2 结果

2.1 病原菌鉴定

通过细菌16SrDNA序列测序的方法对从病虾肝胰腺分离出的细菌进行种属鉴定结果为肠棕气单胞菌、最小弧菌和霍乱弧菌。

2.2 病原菌的药敏试验结果

3株细菌对7种抗菌药物的最小抑菌浓度如下表所示。

参照2013年抗菌药物敏感性试验执行标准，肠棕气单胞菌、最小弧菌、霍乱弧菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹均敏感，对磺胺间甲氧嘧啶钠耐药。

3株细菌对7种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）对照表（单位：μg/mL）：

2.3 WSSV PCR检测结果

PCR检测结果显示病虾WSSV病毒阳性检出率为100%，如下图所示。

WSSV PCR检测结果

M：DNA Marker（自上到下依次为2000、1000、750、500、250、100bp）；1.阳性对照；2.阴性对照；3.采样编号SH20052601；4.采样编号4SH2005260202；5.采样编号SH20052603

3 讨论与分析

从发病小龙虾肝胰腺分离到的3个细菌，通过细菌16SrDNA序列测序的方法，确定为肠棕气单胞菌、最小弧菌和霍乱弧菌。通过药敏试验表明三种细菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹均敏感，对磺胺间甲氧嘧啶钠耐药。

PCR结果表明生病小龙虾中都感染了WSSV（白斑综合征病毒），目前尚无有效的治疗药物。在养殖过程中如果出现死虾，在远离养殖塘处掩埋病虾，及时售卖池塘中的龙虾，既可降低养殖密度，也可以降低损失；对于捕到地笼里的龙虾不可回塘。

资金项目：江苏现代农业（克氏原螯虾）产业技术体系建设专项（JATS〔2020〕297）

（通联：223953，江苏省泗洪县归仁镇政府 手机：15161233108）