混菌发酵玉米豆粕型饲料最佳菌种配比研究

刘 杭， 李 笑， 谢苗苗， 胡 建， 胡忠泽

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

发酵饲料作为一种新型绿色饲料已经备受关注,自“禁抗令”颁布以来,关于微生态制剂方面的研究已成为热点。饲料经微生物发酵,其中大分子营养物质被转化成小分子,更有益于机体吸收利用,提高动物生产性能,发酵产生的酸香味可以改善饲料的适口性,微生物分泌的各种酶还能消除饲料中的抗营养因子,同时,微生物发酵能够产生大量有机酸,可以抑制有害微生物生长繁殖,维持肠道菌群平衡和健康,具有很好的疾病防治作用。微生物发酵方式已从单菌发酵逐渐转向混菌发酵,乳酸菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌是常见的发酵菌,乳酸菌是厌氧菌,主要作用是产酸,酵母菌属于兼性厌氧菌,能够产生有机酸和分泌大量酶产生菌体蛋白,枯草芽孢杆菌是好氧菌,能够分泌大量酶。目前关于发酵饲料的研究多基于这三种菌,包括单菌和混菌发酵。黑曲霉能够产生纤维素酶和果胶酶,分解细胞壁,促进细胞中有效成分的释放,将其用于发酵不仅可改善发酵效果,同时黑曲霉的好养作用还能快速为后期的厌氧发酵创造条件。而目前关于黑曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌及酵母菌4种菌混合发酵的研究较少,因此,本研究基于黑曲霉强大的分解作用基础上,联合乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌四种复合菌混合发酵玉米豆粕型饲料,研究不同菌种比例对发酵结果的影响,筛选出最佳复合菌配比,为生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 发酵原料 玉米粉60%、豆粕30%、麸皮10%，均为市售。

1.1.2 发酵菌种 乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉,均由实验室保存。

1.1.3 培养基 乳酸菌培养基:葡萄糖2.0 g、蛋白胨1.0 g、牛肉膏1.0 g、酵母膏0.5 g、柠檬酸氢二铵0.2 g、吐温0.1 mL、乙酸钠0.5 g、磷酸氢二钾0.2 g、硫酸镁0.058 g、硫酸锰0.025 g、蒸馏水100 mL,2 mol/L NaOH调节pH至6.2～6.6,121 ℃高压蒸气灭菌20 min。枯草芽孢杆菌培养基:葡萄糖2.0 g、蛋白胨1.5 g、氯化钠0.5 g、牛肉膏0.05 g、蒸馏水100 mL,2 moL/L NaOH调节pH至7.2,121 ℃高压蒸气灭菌20 min。酵母菌培养基:葡萄糖2.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母膏1.0 g、蒸馏水100 mL,121 ℃高压蒸气灭菌20 min。黑曲霉培养基:马铃薯20 g、葡萄糖2.0 g、蛋白胨1.0 g、蒸馏水100 mL,121 ℃高压蒸气灭菌20 min。

1.2 试验设计

以乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉为4个因素,每个因素设计3个水平,按照L(3)正交试验设计9组菌种比例组合,具体见表1。

表1 混菌发酵最佳菌种配比筛选正交设计

1.3 试验方法

1.3.1 发酵液培养 将冻存的菌种黑曲霉、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌接种于相应的固体平板上,培养2 d后,选取单菌落接种于相应液体培养基,酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌于37 ℃培养箱中静置培养24 h,黑曲霉于28 ℃培养箱160 r/min震荡培养48 h,再将上述培养液以5%的接种量分别接到各菌种子培养液中继续培养24 h得发酵种子液,采用稀释涂布平板法检测活菌数量,各菌数量达到10CFU/mL时,即可使用。

1.3.2 发酵方法 本试验采用生料发酵,称取一定量玉米豆粕型饲料于托盘中,加入定量菌液和蒸馏水,混合均匀后装进发酵袋密封发酵,先有氧后无氧,将设定的各菌种比例,总接种量按4%,初始水分质量分数为36%,30 ℃下分别发酵48、72、96 h,发酵结束后检测各项指标,试验分为9组,每个处理3个重复。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 pH值 称取发酵后的样品10 g于烧杯中,加入蒸馏水90 mL,磁力搅拌10 min后用pH计直接测定。

1.4.2 乳酸含量 将测完pH的试样离心,取上清液5 mL于10 mL试管中,加入20%硫酸铜0.5 mL,漩涡混匀5 s后,4 000 r/min离心10 min,取上清液0.04 mL,用对羟基联苯比色法测定。

1.4.3 干物质回收率(DMR) 按原料发酵前后干物质重计算。

1.5 数据处理

利用统计分析软件SPSS 20.0的单因素ANOVA方差分析,Duncan法进行多重比较,最终结果用“平均值±标准误”表示,

P

<0.05表示差异显著,

P

>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后pH的影响

由图1可知,随着发酵时间的延长,pH的变化总体趋势是降低的,且降低的越来越慢,相同条件下不同菌种比例发酵产物pH值不同,不同的发酵时间pH值的变化趋势几乎相同,其中,第1、5、9组pH值相比较其他组低,第9组pH值最低,发酵至96 h时pH值低至4.28。

图1 不同菌种比例发酵玉米豆粕后pH的变化

2.2 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后乳酸含量的影响

由表2可知,添加不同比例的乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉对玉米豆粕型饲料进行混合发酵,发酵产物中乳酸的含量存在明显差异,随着发酵的进行,乳酸含量逐渐升高。第9组乳酸含量在发酵48 h达4.62%,较其他组差异显著(

P

<0.05),第1、3、5、6、7、8组间乳酸含量差异不显著(

P

>0.05)。第9组乳酸含量在发酵72 h和96 h时较其他各组显著升高(

P

<0.05),乳酸质量分数分别为5.99%和6.68%菌种组合为黑曲霉∶乳酸菌∶酵母菌∶枯草芽孢杆菌为3∶3∶2∶1。

表2 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后乳酸质量分数的影响

2.3 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后DMR的影响

由表3可知,玉米豆粕经微生物的分解作用会有一定的干物质损失,随着发酵时间的延长,干物质损失的越来越多,DMR逐渐降低。发酵开始至第48 h时,除第7组干物质损失为2.54%,其他各组差异均不显著(

P

>0.05),干物质损失在1.03%～1.85%。发酵第72 h时,9组间DMR无显著性变化(

P

>0.05),均值均在95.40%。发酵至96 h,第5、6、8组DMR较低,较其他各组差异显著(

P

<0.05),其他各组间无显著差异,DMR均值为93.63%。

表3 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后DMR的影响

3 结论与讨论

3.1 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后pH的影响

多菌混合发酵可以发挥微生物的互补作用,其中黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酵母菌的繁殖为乳酸菌的生长创造了厌氧环境,乳酸菌增殖可以产生大量代谢产物有机酸,从而使发酵底物pH值下降,抑制其他有害微生物的生长。黑曲霉是一种纤维素降解酶,郭凯用黑曲霉、干酪乳杆菌及枯草芽孢杆菌发酵棉花秸秆后pH值显著下降,从发酵前的6.8降至3.68。亓秀晔等用酵母菌和乳酸杆菌混合发酵泌乳母猪料,检测发酵不同时间发酵后pH变化发现,随发酵时间延长pH逐渐降低,且降低的越来越慢,与本试验结果一致。有研究表明,混菌发酵可对酵母菌及乳酸菌的代谢产物进行调控,刺激酵母菌与乳酸菌之间的共生作用,最终使乳酸菌大量繁殖产酸,pH值降低的越来越慢可能是因为随着发酵的进行,底物中酸的累计使乳酸菌的活性受到抑制,产酸减少。本研究结果显示,相同条件下第9组发酵pH值下降的最快,发酵效果最好,黑曲霉、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌之比为3∶3∶2∶1,可能由于该菌种配比利于各菌间的协同共生,各菌能够快速繁殖,促进有机酸的生成,从而使pH快速下降。

3.2 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后乳酸含量的影响

乳酸是乳酸菌分解碳水化合物的主要产物,乳酸可以很好的调控动物机体内微生态环境,抑制病原菌生长,提高抗病力促进动物健康生长,因此乳酸含量是评价微生物发酵效果的一个重要标准。混菌发酵过程中,不同菌种比例对发酵结果的影响不同。为研究混菌发酵浓缩饲料的最佳工艺参数,崔艳红等用毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌三种混合菌发酵浓缩饲料,发现三种菌接种比例在1∶1∶2时,乳酸质量分数可以升至最高,对比发酵前提高144.74%。吴正可等研究混菌发酵菜籽粕的最佳工艺,当嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的比例在1∶3∶2时,总酸增加率达最高,发酵效果最好。有研究将淀粉和木薯甘蔗渣进行糖化后发酵,研究产物乳酸浓度和产量,发现鼠李糖乳杆菌和凝结芽孢杆菌混合发酵比单独发酵提高了乳酸浓度和产量。本试验结果显示,随发酵时间的延长,饲料中乳酸含量逐渐升高,相同的发酵时间内,黑曲霉、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的添加比例为3∶3∶2∶1时,乳酸含量达最高,发酵效果最优,这可能是由于该菌种组合中,好氧菌能够将发酵基质中氧气快速耗尽,为厌氧菌的生长创造条件,乳酸菌的迅速繁殖从而产生大量乳酸。

3.3 不同菌种比例对玉米豆粕型饲料发酵后DMR的影响

微生物生长繁殖需要能量来源,DMR是反应发酵过程中底物营养损失程度的一个指标,DMR越大,说明底物营养损失越少,微生物生长代谢速度慢,反之,微生物代谢越旺盛。有研究表明,用布氏乳杆菌单菌发酵青贮饲料,DMR较未经处理的青贮饲料相比显著降低,而布氏乳杆菌与植物乳杆菌和或与乳酸片球菌联用可提高单菌发酵的干物质回收率,且添加比例为4∶1时效果最好。王小明等选用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌混合发酵玉米豆粕型基础日粮,在不同的菌种配比条件下,研究DMR的变化,结果表明在发酵72 h后,各组间DMR差异不显著。这与本研究结果一致,本研究显示随着发酵时间的延长,干物质损失逐渐增加,但是发酵时间在48、72 h时,不同菌种比例对发酵后DMR差异不显著,这可能是由于发酵时间过短引起的。

根据发酵后pH值、乳酸含量及DMR结果综合评价,黑曲霉、乳酸菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌的添加比例为3∶3∶2∶1时,玉米豆粕型饲料的发酵效果最优。