7种杨树铅抗性和积累能力的比较研究

石文广，李 靖，张玉红,3，雷静品，罗志斌*

(1.林木遗传育种国家重点实验室，国家林业和草原局森林培育重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091；2.南京林业大学轻工和食品学院，江苏 南京 210037；3.和瑞基因科技有限公司，北京 100102)

采矿、冶炼、蓄电池等工矿业生产活动导致大量重金属铅(Pb)被排放到环境中[1]。绝大多数环境中的Pb最终会沉积在土壤中造成土壤Pb污染。调查显示，我国土壤Pb超标率达1.5%[2]。土壤中的Pb能被植物吸收，进而通过食物链进入人体，威胁人类健康。Pb会严重抑制儿童中枢神经系统发育，引起智力低下，还会对人体肾脏功能、心血管系统和生殖系统造成损伤[3]。

利用植物修复重金属污染土壤，因花费低、环境友好、公众接受度高等特点而备受关注[4]。植物修复重金属污染土壤通常包括两方面：植物提取(phytoextraction)和植物稳定(phytostabilization)[4]。植物提取是指利用植物根系吸收土壤中的重金属并转运到植物地上部分积累，收集植物地上部分，随后焚烧回收重金属，以达到清洁土壤的目的。植物稳定是指利用植物根系吸收、沉淀和络合等作用降低土壤中重金属的移动性，以阻止重金属向地下水的渗漏以及进入食物链。适合Pb污染土壤修复的植物至少需满足两个条件[5]：一是能够耐受高浓度的Pb。Pb不是植物的必需元素，对生物体具有很强毒性。Pb进入植物体内后往往会对植物的光合系统造成损伤，抑制植物生长，降低植物生物量[1]。二是能够积累大量Pb。植物的Pb积累能力直接决定了植物修复Pb污染土壤的效率。植物的Pb积累量不仅取决于植物体内的Pb含量，还取决于植物的生物量。

杨树是我国主要造林树种之一，在我国分布十分广泛，具有生长速度快、根系发达，对不同土壤和气候适应性强，易繁殖等优点。并且，杨树对重金属有较强的耐受能力。例如，欧洲黑杨(Populusnigra)可以在含有220 mg/kg铜的土壤中生长2个月而没有明显中毒症状[6]。灰杨[P.×canescens，无性系(clone, cl.) INRA 717-14B]可以在含有265 mg/kg锌(Zn)的土壤中生长61 d而生物量没有明显降低[7]。群众杨(P. ×popularis, cl. H20)可以在0.2 mmol/L镉(Cd)胁迫下生长20 d而光合作用没有明显降低[8]。笔者前期研究发现，灰杨可以在浇灌3 mmol/L Pb的沙中生长49 d而叶生物量只有轻微降低[9]。得益于快速生长，杨树可以产出大量生物量。利用短期轮伐的种植方式，速生杨每年可产出35 t/hm2生物量[10]。因此，虽然杨树富集重金属的能力低于重金属超富集的草本植物，但是杨树积累重金属的总量往往高于超富集草本植物。在Cd污染土壤的修复实践中发现，杨树每年可以从污染土壤中提取250～1 000 g/hm2的Cd[11]，而Cd超富集植物天蓝遏蓝菜每年可以提取约250 g /hm2的Cd[12]。这些研究表明杨树在重金属污染土壤修复方面具有巨大潜力。

杨属植物具有丰富的遗传多样性，包含5个派系30～40种[13]。不同种杨树的重金属抗性和重金属积累能力存在巨大差异。在过去十几年里，学者通过对比不同杨树对重金属的抗性和积累能力，筛选出在修复Cd/Zn污染土壤方面具有巨大潜力的欧洲黑杨(P.nigra, cl. Poli)、加拿大杨(P.×canadensis, cl. Luisa Avanzo)、毛果杨(P.trichocarpa, cl. Nisqually)、青杨(P.cathayana, cl. Zhonghua 1)、银白杨(P.trichocarpavar.pyramidalis)等[8, 14-16]。然而，目前有关不同种杨树Pb抗性和Pb积累能力的对比研究相对匮乏， 潜在的可用于Pb污染土壤修复的杨树树种较少。为此，本研究选取了灰杨(P.×canescens, cl. B1-714)、美洲黑杨(P.deltoides, cl. N30)、欧美杨(P.×euramericana, cl. S66)、银腺杨(P.alba×P.glandulosa, cl. 84K)、欧洲黑杨(Populusnigra, cl. I35)、群众杨(P. ×popularis， cl. H20)、青杨(P.cathayana, cl. Zhonghua 1)开展评估研究。这7种杨树均为速生杨树，抗逆性较强，在我国均有栽种；此外，已有研究表明这7种杨树具有较高的Cd、Zn等重金属抗性和积累能力[8, 16-19]。笔者用8 mmol/L Pb处理这7种杨树6周,推测这7种速生杨树的Pb抗性和Pb积累能力存在显著差异。为此，对比分析了这7种杨树在Pb胁迫下的光合参数、生长参数和生物量，以及各组织的Pb含量、积累的Pb总量、富集系数和转运系数等，以期为选择具有Pb污染土壤修复潜力的杨树树种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验所用的7种杨树来自林木遗传育种国家重点实验室杨树课题组试验苗圃(北京通州， 39.733 741°E，116.751 993°N)[20]。采集7种杨树1年生插条(直径约1 cm，长约15 cm)，在水中浸泡生根后，移栽到5 L的花盆中进行沙培(每盆种植1株，基质为约4 kg的河沙)；放置在玻璃温室中培养(昼夜温度20～30 ℃，相对空气湿度40%～50%，自然光照)。每株苗木隔天浇灌50 mL的Hoagland营养液。每天浇灌适量蒸馏水，使培养基质含水量保持在70%～80%。苗木长至约30 cm时，每种杨树选取12株长势一致的苗木分成两组，进行Pb处理。考虑到杨树对Pb有较强的耐受能力，为了最大限度地测试杨树Pb抗性和积累的潜力，用8 mmol/L Pb(NO3)2溶液进行处理。隔天对每株苗木浇灌50 mL 处理液[含有0(对照)或8 mmol/L Pb(NO3)2]，处理液和Hoagland营养液错开浇灌。为了消除 Pb(NO3)2附带的氮元素对试验的影响，浇灌8 mmol/L Pb(NO3)2溶液处理的苗木，将浇灌的Hoagland营养液中部分KNO3和Ca(NO3)2用KCl和CaCl2替代。Pb处理持续6周，处理结束时，累计向每株苗木浇灌1 740.48 mg Pb。

1.2 生长监测与光合参数测定

Pb处理期间，每周测量所有杨树苗木的株高(不包含插条)和地径(萌发枝距插条5 cm处)。Pb处理6周后，测量每株杨树苗木的光合参数。每株苗木选取3片成熟叶[叶间隔期指数(leaf plastochron index) 为 7～9]，利用Li-6400便携式光合仪(LiCor Inc, Lincoln, NE, USA)进行测定，具体参数设置参照He 等[21]的方法。

1.3 材料收获与生物量分析

将每株苗木的根、木材、皮和叶分开收获。每株苗木的根在20 mmol/L的EDTA-Na2溶液中浸泡5 min，以清除根表面附着的Pb。各组织称质量后，装入铝箔纸袋中迅速浸入液氮中冷冻。随后，用球磨仪(MM400, Retsch, Haan, Germany)将杨树组织研磨成粉末并储存在-80 ℃冰箱中。取100 mg左右的组织粉末，在60 ℃烘箱中烘干至质量恒定，以计算干湿比。杨树苗木各组织的生物量=组织鲜质量×组织干湿比。计算抗性指数(tolerance index, TI，公式中记为IT)用于评价各杨树树种的Pb抗性[22]。

IT= 处理植株总生物量/对照植株总生物量×100%。

1.4 Pb含量测定

取250 mg左右的组织粉末，加入10 mL 浓硝酸(HNO3)和2 mL 高氯酸(HClO4)，摇匀后静置过夜。随后，在170 ℃下进行消解，完全消解后用超纯水定容至25 mL。用原子吸收分光光度计(Z-2000, Tokyo, Hitachi, Japan)分析消解液中的Pb含量。各组织积累的Pb总量=组织生物量×组织Pb含量。培养基质Pb含量=(浇灌Pb总质量-植物中总Pb积累量)/培养基质质量。用富集系数(bio-concentration factor, BCF,公式中记为CBCF)来评价植物组织从土壤中提取Pb的能力[23]。CBCF=植物组织Pb含量/培养基质Pb含量。用转运系数(translocation factor, TF，CTF)来评价植物将Pb从根中转运到地上部分的能力[23]。CTF=地上部分Pb含量/根中Pb含量。

1.5 数据统计与分析

用Stategraphics Plus(STN, St Louis, MO, USA)进行数据统计分析。分析前，对所有数据进行了正态分布检验。方差分析采用LSD法，当F-test的P值小于或等于0.05时，认为存在显著差异。为了减少 Ⅰ 型误差，所有P值用Tukey法进行矫正。

2 结果与分析

2.1 Pb对7种杨树光合作用的影响

正常情况下，7种杨树的净光合速率存在较大差异，其中欧美杨、欧洲黑杨和青杨的净光合速率最高，分别为15.35、16.04和15.31 μmol/(m2·s)；美洲黑杨的净光合速率最低，为11.17 μmol/(m2·s)(图1A)。Pb胁迫下，欧美杨净光合速率最高，为12.43 μmol/(m2·s)，美洲黑杨和群众杨净光合速率最低，分别为8.11和8.56 μmol/(m2·s)(图1A)。Pb胁迫导致7种杨树净光合速率显著降低，其中群众杨和欧洲黑杨降低较多，分别达38.63%和36.21%，银腺杨和灰杨降低较少，分别为14.49%和17.68%(图1A)。无论是否有Pb胁迫，青杨的气孔导度和蒸腾速率明显高于其他杨树树种(图1B、1C)。Pb胁迫导致美洲黑杨、群众杨和青杨的气孔导度和蒸腾速率显著降低，对灰杨、欧美杨、银腺杨和欧洲黑杨的气孔导度和蒸腾速率影响不显著(图1B、1C)。没有Pb胁迫时，青杨的胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration,Ci)与胞外CO2浓度(Ambient CO2concentration,Ca)之比(Ci/Ca)最高，为0.81，欧洲黑杨Ci/Ca最低，为0.59(图1D)。Pb胁迫导致欧洲黑杨Ci/Ca显著升高，达25.82%， 对其他杨树没有显著影响(图1D)。

不同字母表示不同处理及树种间差异显著。Different letters on the bars indicate significant difference between the treatments and among species.Ci.胞间CO2浓度ntercellular CO2 concentration；Ca.环境CO2浓度ambient CO2 concentration；Pc.灰杨P. × canescens；Pd.美洲黑杨P. deltoids；Pe.欧美杨P. × euramericana；Pg.银腺杨P. alba × P. glandulosa；Pn.欧洲黑杨P. nigra；Pp.群众杨P. × popularis；Pz.青杨P. cathayana。下同。The same below.图1 Pb胁迫对7种杨树光合作用的影响Fig.1 The effects of Pb stress on photosynthesis of the seven poplar species

2.2 Pb对7种杨树生长的影响

正常情况下，7种杨树高生长速率存在差异，其中银腺杨和群众杨高生长速率最快，分别为1.19和1.20 cm/d；青杨高生长速率最慢，为0.88 cm/d(表1)。Pb胁迫下，灰杨和银腺杨高生长速率最快，分别为0.83和0.82 cm/d，青杨高生长速率最慢，为0.58 cm/d(表1)。Pb胁迫显著抑制了7种杨树的高生长，其中群众杨的高生长率降低最大，达45.16%，美洲黑杨和欧美杨的高生长率降低较小，分别为26.38%和28.07%(表1)。无论是否有Pb胁迫，银腺杨径向生长率明显高于其他杨树，分别为0.06(0 mmol/L Pb)和0.05(8 mmol/L Pb)mm/d，而青杨径向生长速率显著低于其他杨树树种，分别为0.05(0 mmol/L Pb)和0.03(8 mmol/L Pb)mm/d(表2)。Pb胁迫显著抑制了7种杨树的径向生长，其中群众杨径向生长率降低最多，达42.44%，欧美杨降低最少，仅为15.57%(表2)。

表1 Pb胁迫对7种杨树高生长的影响

表2 Pb胁迫对7种杨树径向生长的影响

2.3 7种杨树的生物量变化和Pb抗性指数

正常情况下，欧美杨根生物量最高，达3.24 g/株，其他杨树树种相差不大；Pb胁迫时，灰杨和银腺杨根生物量最低，分别为0.78和0.82 g/株，其他杨树树种相差不大(图2A)。除了欧洲黑杨根生物量没有明显变化外，Pb胁迫导致其他6种杨树根生物量显著降低，其中欧美杨降低最多，达50.31%(图2A)。无论是否有Pb胁迫，欧美杨、银腺杨和欧洲黑杨木材生物量较大，而美洲黑杨和青杨木材生物量相对较小(图2B)。Pb胁迫导致欧洲黑杨和群众杨木材生物量显著降低，分别达31.99%和22.26%，其他杨树木材生物量变化不显著(图2B)。无论是否存在Pb胁迫，欧美杨树皮生物量最高，分别达3.03(0 mmol/L Pb)和2.65(8 mmol/L Pb)g/株，其他杨树差异较小(图2C)。Pb胁迫导致欧美杨和群众杨树皮生物量显著降低，分别达12.67%和19.54%，其他杨树变化不显著(图2C)。无论是否存在Pb胁迫，欧美杨叶生物量最高，分别达8.40(0 mmol/L Pb)和7.03(8 mmol/L Pb)g/株，灰杨叶生物量最低，分别为4.29(0 mmol/L Pb)和2.77(8 mmol/L Pb)g/株(图2D)。Pb胁迫导致7种杨树叶生物量显著降低，其中灰杨叶生物量降低最多，达35.44%，欧美杨和银腺杨降低最少，分别为16.31%和16.82%(图2D)。

图2 Pb胁迫对7种杨树生物量的影响Fig.2 The effects of Pb stress on biomass of the seven poplar species

图3 7种杨树的总生物量和Pb抗性指数Fig.3 The total biomass and tolerance indexes of the seven poplar species

无论是否有Pb胁迫，欧美杨的总生物量最高，分别为17.82(0 mmol/L Pb)和14.21(8 mmol/L Pb)g/株，灰杨的总生物量最低，分别为10.29(0 mmol/L Pb)和7.30(8 mmol/L Pb)g/株(图3A)。Pb处理导致7种杨树总生物量显著降低，其中灰杨降幅最大，达29.03%；欧洲黑杨降幅最小，仅12.02%(图3A)。相应地，7种杨树的抗性指数存在较大差异，大小依次为：欧洲黑杨(88.09%)>银腺杨(82.98%)≈美洲黑杨(80.70%)>欧美杨(79.86%)>青杨(76.79%)>群众杨(72.78%)≈灰杨(70.35%)(图3B)。

2.4 7种杨树各组织中的Pb含量

没有Pb胁迫时，7种杨树各组织中的Pb含量几乎为零；8 mmol/L Pb处理后，7种杨树各组织中的Pb含量明显增加(图4)。在根中，美洲黑杨Pb含量最高，达2 906.10 mg/kg，欧美杨和青杨Pb含量最低，分别为751.04和765.60 mg/kg(图4A)。在木材中，灰杨和美洲黑杨Pb含量最高，分别为46.55和46.51 mg/kg，其他杨树差异不大(图4B)。在树皮中，灰杨Pb含量较高，达44.39 mg/kg，欧美杨、欧洲黑杨和群众杨Pb含量较低，分别为13.44、16.02和17.94 mg/kg(图4C)。在叶中，灰杨Pb含量显著高于其他杨树，达325.90 mg/kg，欧洲黑杨和青杨Pb含量最低，分别为51.74和54.08 mg/kg(图4D)。

图4 7种杨树根、木材、树皮和叶中的Pb含量Fig.4 Pb concentrations in the roots, wood, bark and leaves of the seven poplar species

2.5 7种杨树的Pb积累能力

美洲黑杨根中的Pb积累量最高，达4.20 mg/株，灰杨根中最低，仅为0.92 mg/株；而地上部分，灰杨积累量最高，达1.21 mg/株，欧洲黑杨和青杨最低，分别为0.27和0.32 mg/株(表3)。灰杨地上部分的Pb主要积累在叶中，占比达85.95%(表3)。7种杨树积累Pb的总量大小顺序依次为：美洲黑杨(5.06 mg/株)>欧洲黑杨(3.19 mg/株)>群众杨(3.14 mg/株)>银腺杨(2.61 mg/株)>灰杨(2.13 mg/株)>欧美杨(1.91 mg/株)>青杨(1.72 mg/株)(表3)。在7种杨树中，美洲黑杨的根富集系数最高，达6.70，欧美杨和青杨最低，分别为1.73和1.76；灰杨的地上部分富集系数最高，达0.43，欧洲黑杨和青杨最低，分别为0.07和0.10(表3)。7种杨树的Pb转运系数存在较大差异，其中灰杨的Pb转运系数明显高于其他杨树，达0.16，欧洲黑杨的转运系数最低，仅为0.02(表3)。

表3 7种杨树的Pb积累量、富集系数和转运系数

3 讨 论

3.1 7种杨树Pb抗性

Pb是一种高毒性不可降解的重金属。Pb的毒性仅次于砷，即使很少量Pb进入植物体内，也会对植物产生毒害[24]。中度的Pb中毒会抑制植物根系生长，引起植株矮化；严重的Pb中毒则会导致植物叶片萎黄凋落，甚至植株死亡[24-25]。用0.3 mmol/L Pb处理3周后，银合欢(Leucaenaleucocephala)根系生长显著被抑制，植株矮化生长，叶片萎黄凋落[26]。在本研究中，8 mmol/L Pb处理6周后，7种杨树均有根系生长被抑制、矮化生长的症状，但并未出现叶片萎黄凋落和植株死亡(未展示相关数据)，表明7种杨树对Pb胁迫具有较强的抗性。

Pb对植物产生毒害的重要机制之一是Pb对植物生理生化代谢的影响。光合作用是植物生长发育的关键生理生化过程之一，其对Pb胁迫尤为敏感[24]。Pb胁迫会导致杨树的光合作用降低，并且不同杨树的光合作用对Pb胁迫的敏感性不同[18, 27]。例如，在相同Pb胁迫下，欧美杨(cl. Guinier 561/41)的光合速率降低程度低于欧洲黑杨(cl. Linnaeus 63/135)[18]。与已有研究一致，本研究发现Pb胁迫导致7种杨树光合速率降低，并且呈现出明显的种间差异性。Pb胁迫引起的植物光合速率降低主要有3个机制：气孔关闭、光合系统紊乱和叶绿体结构损伤[1]。Pb胁迫导致光合速率降低的机制因植物不同而存在差异，例如，Pb胁迫导致豌豆(Pisumsativum)光合速率降低主要是由于气孔关闭[28]；而Pb胁迫导致紫萍(Spirodelapolyrhiza)光合速率降低主要是由于光合系统紊乱和叶绿体结构损伤[29]。在7种杨树中，欧美杨、欧洲黑杨、群众杨和青杨的光合速率在Pb胁迫下降低程度最大，同时，欧美杨、群众杨和青杨的气孔导度及蒸腾速率明显降低，而欧洲黑杨则没有明显变化，说明欧美杨、群众杨和青杨光合速率的降低可能主要是气孔关闭引起的，而欧洲黑杨则可能主要是光合系统紊乱或叶绿体损伤所致。Pb胁迫往往导致欧洲黑杨叶中丙二醛含量急剧升高[30]。同时，本研究发现欧洲黑杨叶中Ci/Ca在Pb胁迫下显著升高，表明铅胁迫可能导致了欧洲黑杨叶中叶绿体结构损伤，引起光合速率降低。这些结果说明，在7种杨树中欧洲黑杨叶对Pb较为敏感。与之相应，在7种杨树中灰杨叶中的Pb浓度最高，而净光合速率减少量最小，表明灰杨叶对Pb的抗性较强。为了应对Pb的毒害，植物体内形成了一系列的解毒机制，如Pb2+的螯合/络合与区室化等[24]。Pb胁迫时，灰杨叶中会大量积累谷胱甘肽和草酸，并上调ATP-binding cascade C3.1 (ABCC3.1)的表达，增强了Pb2+的螯合/络合以及液泡区室化，可能是灰杨叶Pb抗性较强的主要原因[9]。

Pb胁迫会显著抑制杨树的生长，导致生物量降低[30-32]。不同杨树的生长对Pb的敏感性不同[31, 33]。例如，在相同Pb处理条件下，银白杨(cl. 62/154)的株高和地径降低量显著高于欧洲黑杨(cl. 44/9)[31]；北京杨(P.beijingensis)生物量降低量高于青杨[33]。与已有研究一致，笔者发现Pb胁迫显著抑制了7种杨树的高生长和径向生长，导致生物量降低。Pb胁迫引起的7种杨树生长抑制存在明显的种间差异。笔者发现欧洲黑杨、群众杨和青杨的株高和地径在Pb处理的第1周就出现明显的降低，表明这3种杨树对土壤中的Pb比较敏感。抗性指数是描述植物重金属抗性的重要指标，已有研究表明，不同杨树树种对镉、锌等重金属的抗性指数存在明显差异[16, 34]，本研究发现与其他重金属一样，7种杨树对Pb的抗性指数同样存在较大差异。值得注意的是，在7种杨树中，在光合和生长方面对Pb胁迫都十分敏感的欧洲黑杨，其Pb抗性指数最高。已有研究发现，欧洲黑杨根具有较强的Pb胁迫防御能力，能够将Pb固定在细胞壁上，将Pb转化为沉淀态和区室化到细胞液泡中，降低Pb向地上部分转运[35]。因此，虽然欧洲黑杨生理生化过程对Pb很敏感，但高效的防御机制，有效地降低了Pb在关键生理代谢组织的积累，使其具有较高的Pb抗性。

3.2 7种杨树Pb积累能力

植物修复Pb等重金属污染土壤的关键是植物对土壤中Pb等重金属元素的吸收和在植物地上部分的积累[36]。已有研究表明，虽然不同杨树吸收和积累Pb的能力存在一定差异，但是几乎所有已研究的杨树根中的Pb含量显著高于地上组织[33, 37-39]。例如，北京杨根中的Pb含量是地上部分的约200倍[33]；欧美杨(cl. Dorskamp)根中的Pb含量是地上部分的约400倍[39]。本研究同样发现7种杨树吸收和积累Pb的能力存在差异，同时7种杨树根中的Pb浓度是地上部分的7～30倍。在相同条件下，杨树各组织中的Pb含量通常低于草本植物[40-41]。但是，杨树的快速生长，使其积累Pb的总量往往高于草本植物[42]。例如，在140 mg/kg Pb的土壤中，杨树(P.nigra×P.maximowiczii)能够积累629 μg/株的 Pb，其中地上部分有239 μg/株，而玉米(Zeamays)和向日葵(Helianthusannuus)分别仅积累了88 μg/株和176 μg/株的Pb，其中地上部分分别有68 μg/株和98 μg/株[42]。本研究发现，美洲黑杨积累Pb的总量高达5.06 mg/株，灰杨地上部分积累的Pb总量高达1.21 mg/株，表明这两种杨树可能在修复Pb污染土壤方面潜力巨大。美洲黑杨和灰杨能够大量积累Pb可能与它们体内与Pb转运和解毒相关的基因高表达有关。研究发现，Pb胁迫下，美洲黑杨根中可能含有参与Pb吸收和解毒的基因，如natural resistance associated macrophage protein 1.3 (NRAMP1.3)、ABCC1.1、ATP sulfurylase 1 (ATPS1)等显著上调表达，促进了根系吸收和积累Pb[43]；铅胁迫引起灰杨根中可能参与Pb吸收和转运的基因，如NRAMP1.3、NRAMP1.4、ABCG40、ferric reductase defective3.1(FRD3.1)等，显著上调表达，促进了根系吸收Pb，并将其转运至地上部分[9]。

7种杨树的Pb抗性和Pb积累能力存在显著差异。其中欧洲黑杨的Pb抗性指数最高，根的Pb积累能力仅次于美洲黑杨，Pb转运系数最低；美洲黑杨的Pb抗性仅次于欧洲黑杨，根和整株的Pb积累量最大，根富集系数最高，但Pb转运系数较低；灰杨的Pb抗性指数最低，但地上部分Pb积累量最大，地上部分富集系数和转运系数最高。这些结果表明，欧洲黑杨和美洲黑杨可能在Pb污染土壤的植物固定和生态恢复方面具有较大潜力，灰杨则在Pb污染土壤的植物提取方面具有很大潜力。