NDRG2通过抑制Bcl-2表达增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性

李瑞晓，唐启胜，马善金，张 波，李雪莲，张志明

1.空军军医大学唐都医院泌尿外科，陕西 西安 710038；2.西安市中医医院外科，陕西 西安 710002

目前，晚期膀胱癌的治疗主要是基于顺铂（cisplatin，CDDP）的辅助治疗，在根治性膀胱切除术前/后或晚期辅以CDDP为主的化疗是目前的主要治疗手段［1］。然而，由于对化疗药物的耐药性产生，CDDP的疗效有限，化疗有效率约为50%。Bcl-2在与抗癌药物（如CDDP）诱导的DNA损伤相关的细胞凋亡中起关键作用，Bcl-2的过表达赋予了细胞多药耐药性，并且临床数据已将Bcl-2表达水平与CDDP耐药和复发性疾病联系起来［2］。N-Myc下游调节基因2（N-Myc down stream-regulated gene 2，NDRG2）是一种新发现的p53诱导基因，被认为参与DNA损伤诱导的p53相关凋亡途径并在抑制增殖中发挥作用。我们的前期研究发现，NDRG2基因的过表达可在体内/外抑制膀胱肿瘤的增殖及侵袭能力［11］。鉴于先前的研究，关于NDRG2基因在膀胱癌耐药机制的研究比较少，因此本研究旨在探讨NDRG2是否通过与Bcl-2相互作用而影响膀胱癌细胞耐药的形成，为临床治疗晚期膀胱癌提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌细胞系T24购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，并在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM中于37 ℃、CO2体积分数为5%的温箱中培养。为了培育出抗CDDP的亚型，将T24细胞于含有CDDP（浓度递增：0.1～1.0 μg/mL）的培养基中连续传代，持续6个月。最终将CDDP抗性细胞株于含有1 μg/mL CDDP的培养基中培养。

1.2 基因修饰和转染

将编码全长NDRG2的cDNA亚克隆到pcDNA3.1载体（美国Invitrogen公司）中，通过转染构建NDRG2基因过表达T24细胞株，同时采用小干扰RNA（siRNA）技术构建NDRG2及Bcl-2基因沉默细胞株。根据制造商的说明书，使用LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）用相应的分子克隆载体转染目的细胞。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测

将膀胱癌细胞溶解于蛋白裂解液［宝生物工程（大连）有限公司］提取目的细胞的总蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离细胞裂解物并转移至硝酸纤维素膜。选取NDRG2、Bcl-2、多药耐药蛋白一抗（美国Santa公司）与NC膜温育过夜，然后在与目的蛋白匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗中温育。用计算机-荧光扫描仪系统对膜进行扫描，进行数据分析。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

严格按照提取试剂盒（美国Invitrogen公司）操作说明进行，使用TRIzol试剂从膀胱癌细胞中提取总RNA。将提取的RNA在紫外分光光度计下检测，读取260 nm处的吸光度（D260nm）值以及D260nm/D280nm比值，按照美国Invitrogen公司反转录系统将RNA反转录合成cDNA。每个PCR程序：35个循环（对于NDRG2基因），94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s；共25个循环（对于Bcl-2基因），在94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，然后72 ℃，延伸10 min。通过2-ΔΔCt法计算各组mRNA表达量并进行比较，最后进行数据分析。

1.5 细胞毒性测定

MTT法分析CDDP对膀胱癌细胞生长的影响。调整细胞浓度1×104个/mL以200 μL等分接种到96孔板中。加入不同浓度的CDDP在37 ℃下温育72 h后，向每个孔中加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），并将96孔板在37 ℃下再温育4 h。然后除去培养基并用150 μL 100%DMSO代替，搅拌溶解5～10 min。使用多孔扫描分光光度计在490 nm处测量D值。细胞活力表示为未处理细胞的百分比。每种实验条件重复3次。

1.6 检测细胞凋亡

将膀胱癌细胞用CDDP（所需浓度）处理 24 h。用荧光素异硫氰酸酯标记的膜联蛋白Ⅴ和碘化丙锭染色凋亡细胞。使用荧光细胞分选仪测量凋亡细胞。

1.7 Transwell小室检测

采用transwell小室检测确定细胞的侵袭能力。将目的细胞培养48 h后收集细胞。将细胞（2×104个细胞/孔）重悬于200 µL无血清培养基中，并置于上室中。底部腔室覆盖有500 µL RPMI-1640和20%FBS。温育36 h后，将膜固定并分别使用4%多聚甲醛和结晶紫染色。然后在光学显微镜下计数侵袭的细胞。所有实验均包括3个独立的重复。

1.8 统计学处理

选用统计学软件SPSS 19.0进行数据分析，数据表示为。通过使用单向ANOVA及组间χ2检验来进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 CDDP不同浓度处理下T24、T24/CR细胞中NDRG2蛋白的表达情况

通过浓度递增的方式用CDDP处理膀胱癌T24细胞，然后通过分光光度法评估不同浓度CDDP处理T24细胞和CDDP抗性细胞（表示为T24/CR）的活力状态以及NDRG2蛋白的表达水平。结果发现，在浓度＜1 μg/mL时，T24/CR细胞具有继续生长的抗性（图1A）。Western blot结果显示，与亲代T24细胞相比，T24/CR细胞中NDRG2的表达水平显著下调（图1B）。此外，低浓度CDDP处理T24细胞，发现其以时间依赖性方式刺激NDRG2表达（图1C）。

图1 CDDP耐药的产生影响NDRG2蛋白的表达Fig.1 The development of CDDP resistance affects the expression of NDRG2

2.2 NDRG2蛋白过表达增强了T24细胞中CDDP的敏感性

将外源性NDRG2基因转染至T24/CR细胞中并使其稳定过表达（图2A）。通过MTT及凋亡检测证实，实验组中T24/CR细胞的增殖受到显著抑制，凋亡比例增加（图2B、C）；在细胞侵袭实验中，实验组T24/CR细胞的侵袭受到显著抑制（图3）。这些研究结果表明，NDRG2蛋白的过表达可增强CDDP抗T24细胞的敏感性。

图2 NDRG2过表达可以影响T24/CR细胞的活力及凋亡水平Fig.2 Overexpression of NDRG2 could affect the viability and apoptosis of T24/CR cells

图3 NDRG2过表达可抑制T24/CR耐CDDP细胞侵袭能力Fig.3 Overexpression of NDRG2 could inhibit resistance to cisplatin in T24/CR cells

2.3 过表达NDRG2抑制T24/CR细胞中Bcl-2的表达

为了进一步说明NDRG2蛋白在CDDP诱导的细胞凋亡中的作用，通过Western blot检测T24/CR细胞中Bcl-2的表达。与T24/CR细胞相比，过表达实验组T24/CR细胞中，Bcl-2的表达受到抑制，P-糖蛋白和多药耐药蛋白的表达未受明显影响（图4），通过shRNA转染使NDRG2在T24细胞中低/不表达。随后用Bcl-2-siRNA瞬时转染下调了NDRG2在T24细胞中的表达，并使Bcl-2表达上调，结果显示对NDRG2的表达没有影响（图5A），表明NDRG2可能作用于Bcl-2信号转导的上游。

图4 NDRG2 过表达可抑制T24耐CDDP细胞中Bcl-2的表达Fig.4 Overexpression of NDRG2 could inhibit the expression of Bcl-2 in T24/CR cells

2.4 Bcl-2基因的抑制修复了NDRG2基因的缺陷，恢复膀胱癌细胞对CDDP的敏感性

我们研究了NDRG2对Bcl-2基因的激活是否通过改变T24细胞活力和细胞凋亡而引起CDDP抗性。用0.5 μg/mL CDDP温育24 h导致T24细胞活力显著降低和诱导细胞凋亡，而NDRG2的表达抑制导致T24细胞活力增强和凋亡减弱而引起明显的CDDP抗性。更重要的是，下调Bcl-2的表达可有效解除NDRG2低表达对T24细胞活力和凋亡的影响，并恢复CDDP对T24细胞的敏感性（图5B、C）；反过来，增加NDRG2的表达，可增强CDDP诱导T24细胞凋亡的敏感性。

图5 NDRG2调节Bcl-2的表达Fig.5 NDRG2 regulated the expression of Bcl-2

3 讨 论

铂类药物，特别是CDDP，被广泛用于治疗多种实体恶性肿瘤，包括膀胱癌。然而，一些肿瘤患者在治疗前或治疗过程中会出现对CDDP的耐药性。CDDP的耐药率高也是肿瘤患者化疗失败的主要原因。虽然最近提出了CDDP耐药的靶前、靶上、靶后和脱靶机制学说［3］，但CDDP耐药的分子机制仍不完全清楚。

Bcl-2在线粒体凋亡中起关键作用，Bcl-2的表达可以预测接受放化疗的晚期膀胱癌患者的存活率［12］，Bcl-2蛋白表达的上调可能是膀胱癌细胞出现CDDP耐药的机制之一，通过下调Bcl-2的表达有助于逆转膀胱癌细胞对CDDP耐药 性［13］。NDRG2对细胞功能的调节有两种相反报道，NDRG2在局灶性脑缺血中表现出抗细胞凋亡功能［4］，并且在乳腺癌细胞中具有一定的放射抗性［5］。相反，它在尿路上皮癌［6］、乳腺癌细胞［7］、肝癌［8］中表现出促凋亡的功能。研究［12］发现，敲除NDRG2基因可抑制Bcl-2的表达，从而增加宫颈癌HeLa细胞CDDP敏感 性。我们的前期研究已经证实，NDRG2在膀胱癌中发挥着重要的作用，NDRG2在膀胱癌组织中低表达，并且与患者生存呈负相关，体内/外实验证实，过表达NDRG2可抑制膀胱癌细胞的增殖及侵袭能力［11］。因此，本研究旨在探讨NDRG2可否增加膀胱癌细胞对CDDP的敏感性，从而改善膀胱癌患者的预后和生存率。本研究表明，过表达NDRG2可显著抑制Bcl-2的表达，NDRG2可能通过抑制Bcl-2的表达而诱导膀胱癌细胞的凋亡。NDRG2在转录后水平调节Bcl-2表达。已有研究［9］表明，Bcl-2可被胃癌细胞中的microRNA（如miR-15b和miR-16）靶向和调节。这些microRNA与Bcl-2 mRNA的3’非翻译区结合，抑制Bcl-2蛋白的翻译而不改变mRNA表达。Bcl-2的上调是某些肿瘤对放化疗产生耐药的原因之一［10］。然而，目前对化疗反应中控制Bcl表达的转录后或翻译后调控机制知之甚少。

本研究发现，上调NDRG2的表达后，T24/CR耐药细胞的凋亡比例增加，且侵袭性受到抑制，同时Bcl-2的表达受到抑制。是否NDRG2的表达调节了Bcl-2的表达，我们进一步进行了验证，通过siRNA技术使NDRG2在T24细胞中低/不表达。更重要的是，下调Bcl-2的表达可有效解除NDRG2低表达对T24细胞活力和凋亡的影响，并恢复CDDP对T24细胞的敏感性；反过来，增加NDRG2的表达，可增强CDDP诱导T24细胞凋亡的敏感性。

研究表明，NDRG2与CDDP的敏感性增加有关，而细胞的耐药与诱导细胞凋亡的Bcl-2有关，本研究证实NDRG2可调控Bcl-2的表达从而增加膀胱癌CDDP敏感性。这些数据可以帮助我们更好地了解CDDP耐药的分子机制以及NDRG2在肿瘤发展中的确切作用。