陇西腊肉传统制作过程中细菌群落演替对脂肪水解及氧化的影响

李彦虎，贠建民，赵风云，张紊玮，艾对元

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

传统陇西腊肉一般在每年冬至来临之际至来年立春集中制作，主要以猪肉为原料，剔除中躯鲜肉肩胛骨、肱骨或胸肋骨，分割成10～15 kg的肉胚块，采用干腌法腌制（香辛料、5%食盐）、经自然风干工艺加工而成的一种发酵肉制品[1]。陇西腊肉因其独特的腊香味深受人们喜爱，这种腊香味的形成与脂肪水解、氧化具有着密不可分的联系[2-3]。

研究腌腊肉制品风味产生途径发现，脂肪的水解、氧化对腌腊肉制品风味形成的贡献很大[4-5]。脂肪分子在内源性脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，游离脂肪酸以及脂肪又将通过3 种氧化途径（自动氧化、酶促氧化、光氧化）使得脂肪大分子彻底降解生成小分子，如醛、醌、醇、脂肪酸、烃类，同时赋予了腌腊肉制品独特的腊香味[6-9]。以上研究说明非生物因子在脂肪水解及氧化过程中扮演了重要的角色。

传统腌腊肉制品制作过程中富集了大量的微生物，并且这些微生物展现了许多重要的功能。已经明确的功能主要包括：促使蛋白质降解形成肽和氨基酸[10-13]；增加产品挥发性组分含量[14]；抑制生物胺的产生[15]；以及促进碳水化合物分解[16]；促进脂肪的降解及氧化[17]。除此之外，腌腊肉制品微环境中丰富的微生物组还有许多潜在功能尚待挖掘。近年来，腌腊肉制品中微生物研究手段也随着基因测序技术的进步而蓬勃发展，基于高通量测序技术的免培养方法为全面、真实地了解环境中微生物群落结构提供了可能[18]。高通量测序技术已逐渐应用于香肠[19]、火腿[20]、风干肉[21]等发酵肉制品微生物种群特性的研究中。

目前，关于微生物因素在发酵肉制品脂肪代谢过程中发挥重要作用的研究已成该领域研究热点之一，如培根[22]、酸鱼[23]、意大利发酵肠[24]、酸肉[25]等，而鲜见陇西腊肉中的此类研究。因此，研究陇西腊肉制作过程中细菌群落演替对脂肪水解及氧化的影响十分必要。本实验以传统陇西腊肉为材料，采用高通量测序技术重点研究并分析腊肉制作过程中细菌群落演替现象，并结合气相色谱-质谱联用技术检测制作过程中挥发性脂肪酸组成以及肉过氧化值和酸价的变化，以期明确陇西腊肉制作过程中细菌群落演替对脂质水解及氧化的影响规律，为解析脂肪代谢影响因素以及进一步揭示陇西腊肉风味形成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陇西腊肉，采自甘肃省陇西县大胡子传统腊肉生产基地。

E.Z.N.A. Soil DNA提取试剂盒 美国Omega公司；Qubit 2.0 DNA检测试剂盒 美国Invitrogen公司；凝胶回收试剂盒 美国Axygen公司；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 美国Illumina公司。其余有机试剂均为国产色谱纯。

1.2 仪器与设备

7000D三重四极杆气相色谱-质谱联用仪（配有电子电离源和NIST质谱数据处理系统）、PAL3自动三合一进样器系统 美国Agilent公司；Q32866型Qubit 2.0荧光计 美国Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；SW-CJH-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；754PC紫外-可分光光度计上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腊肉样品采集

本实验跟踪采集陇西腊肉一个批次（约6～8 t）生产完整过程。根据制作周期确定5 个时间点（表1）。采样完成后样品置于冰盒内当天运回实验室进行分样，每份样品不少于500 g。每个时间点的样品采集3 个平行样品，然后均匀混合，准确称取样品（规格：10 g/管）分装于若干个无菌取样管，并按照不同采样时期编号，以上过程均在超净工作台内完成，经液氮冷冻后存于-80 ℃冰箱，以备微生物检测以及脂肪酸等指标的测定。

表1 样品信息Table 1 Information about bacon samples tested in this study

1.3.2 腊肉微生物总DNA的提取与测序

采用DNA提取试剂盒，参照说明书从样品中提取DNA；然后使用Qubit 2.0分光光度计对提取的DNA进行定量，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取结果。PCR扩增16S rRNA V3-V4区，引物序列：338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。Illumina MiSeq高通量测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.3.3 高通量测序数据处理[26-28]

采用Mothur（version 1.31.2）和QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，version 1.7.0）软件处理及分析高通量测序数据。使用UCHIME（version 4.2）软件鉴定和去除嵌合体序列。将序列分配入对应样本，使用UCLUST算法进行序列聚类，以97%的序列相似度作为划分阈值，将样品聚类成可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）。利用Mothur（version 1.31.2）软件进行α多样性分析，其中包括Simpson指数、Chao1指数和Shannon指数，并在不同的分类水平上对群落结构进行统计分析。并使用R（version 2.15.3）软件进行可视化。通过PICRUSt（version 1.0）软件对群落基因功能特征进行预测。

1.3.4 脂肪酸价、过氧化值的测定

参照GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》[29]测定腊肉酸价；参照GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[30]测定腊肉过氧化值。

1.3.5 游离脂肪酸测定

游离脂肪酸提取及甲酯化[31]：准确称取肉样品1 g，装入具塞试管，并加入0.7 mL 10 mol/L氢氧化钾溶液和5.3 mL无水甲醇，于55 ℃恒温水浴1.5 h，每隔20 min振摇试管5～10 s，水浴结束后取出试管，自来水冷却至室温，然后加入0.58 mL 12 mol/L H2SO4溶液，55 ℃继续水浴1.5 h，同时每20 min振摇5 s，用自来水冷却，加入3 mL正己烷萃取，摇匀后转移至离心管，3 000 r/min离心5 min，用0.22 μm有机膜过滤上清液，每个样品不低于1 mL，进行气相色谱-质谱检测。

气相色谱条件：色谱柱：VF-WAX ms毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率上升至180 ℃保持3 min，以4 ℃/min升温至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升温至245 ℃，保持15 min；载气（He）流速1.0 mL/min，压力2.4 kPa，液体进样，进样量1 μL；分流比10∶1。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；母离子m/z265；激活电压1.0 V；质量扫描范围m/z40～400。溶剂延迟4 min。

采集到的质谱数据经NIST12数据库检索定性，将匹配度大于800作为鉴定依据，通过峰面积归一化法计算各组分相对峰面积。

1.4 数据处理

理化实验数据经3 次平行实验后得到，采用Excel软件对数据进行统计处理，Origin 9.0绘制图表，SPSS 19.0进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同时期腊肉中细菌群落多样性分析

表2 腊肉样品中细菌α多样性分析Table 2 α Diversity of bacteria in bacon samples

基于Illumina MiSeq双端测序法对陇西腊肉样品中提取的微生物总DNA的V3-V4区进行测序，并对测序结果进行整理、过滤。结果显示，所有样品共检出186 866 条有效16S rRNA基因序列（表2）。所有样本的覆盖范围86.3%～95.4%不等，这表明测序深度能够代表腊肉中存在的细菌系统型大部分已经被捕获。采用QIIME软件按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，所有样品中总共得到580 个OTU，OTU数可以反映出样品中细菌的丰度。通过Chao1指数和Simpson、Shannon指数分析样品中微生物组的α多样性（表2）。Chao1指数是群落丰度指数，Chao1指数越大，表明样品微生物群落丰度越高；Shannon指数是群落分布多样性指数，Shannon、Simpson指数越大，表明样品微生物多样性越高。结果表明，所有样品中的Chao1指数及Shannon、Simpson指数在T90样品中最大，表明T90样品中微生物群落丰度以及多样性最高，T60样品次之，这说明在风干期陇西腊肉中微生物丰度和多样性最高，也间接显示陇西腊肉风干阶段是重要的后发酵时期，这可能是由于腌制期氯化钠本身的毒害作用以及渗透压升高对细菌的抑制作用导致腌制期内细菌丰度和多样性低于风干期。加之，本实验室前期研究成果表明，腌制中期pH值（5.87）低于风干期（6.16），说明pH值也是影响腌制期与风干期微生物差异的原因；另外，从腌制期到风干期水分活度逐渐降低，至成品期时水分活度降至0.831，但腌制中期时水分活度为0.96，适宜于绝大多数微生物生长，可见水分活度不是影响该时期细菌多样性变化的主要原因[32]。

2.2 不同时期腊肉中细菌群落分类统计分析

图1 细菌门水平（A）和属水平（B）相对丰度Fig.1 Relative abundance of bacteria at the phylum (A) and genus level (B)

为揭示各时期样品群落动态演替规律，统计样品中菌群相对丰度。如图1A所示，总共有15 个细菌门被检出，但平均相对丰度大于1%的菌门有6 个。整个过程中，Proteobacteria和Firmicutes占优势，Proteobacteria的相对丰度最高，占63.84%～81.34%，Firmicutes占8.9%～30.4%，Actinobacteria相对丰度为1.3%～5.2%，Cyanobacteria相对丰度为0.1%～5.5%，其他菌门相对丰度均低于0.1%。属分类水平下，样品中共检测到414 个细菌属，相对丰度位于前25 位的菌群分布见图1B。在整个过程中Brochothrix、Carnobacterium、Lactobacillus、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Cupriavidus平均相对丰度最高，为优势菌。董蕴等[33]研究发现湖北恩施地区腊肉中优势细菌属为Staphylococcus、Psychrobacter、Pseudoalteromonas、Brochothrix、Cobetia、Acinetobacter，与本研究结果相似。由于陇西腊肉整个制作过程肉胚温度均低于10 ℃，这可能是嗜低温菌群成为优势菌的主要原因，如Brochothrix、Pseudoalteromonas、Psychrobacter，而且本实验中优势菌群存在明显的演替现象。例如，Psychrobacter在T15样品中达到最高相对丰度（56%），随后逐渐降低。Brochothrix在T30样品达到最高相对丰度（17.9%）。Lactobacillus相对丰度在T60样品最高（8.5%），T90样品又降至5.3%。Pseudoalteromonas相对丰度由T0样品0.6%增加至T90样品的5.2%。Carnobacterium相对丰度由T0样品的5.5%降低至T90样品的0.8%。Cupriavidus在T0样品中达到最高，随后逐渐降低。除此之外，Staphylococcus相对丰度在T15样品最高（5.6%），随后逐渐降低。Micrococcus由T0样品的1.4%降至T90样品的0.4%。Streptococcus由T0样品的1.4%降至T90样品未检出。

图2 属水平细菌丰度热图Fig.2 Heat map showing bacterial community abundance at the genus level

为了更直观地呈现陇西腊肉制作过程中优势细菌的群结构及丰度变化，使用R软件，对相对丰度位于前50 位的细菌属绘制热图（图2）。通过聚类，可以将高丰度和低丰度的分类单元加以区分，并以颜色梯度反映样本之间的群落组成相似度。所有样品分为3 组（T0-T15、T30、T60-T90），即腌制期、腌制后期、风干期。随着不同工序的进行，原料肉从加入腌料腌制到自然风干过程中，细菌发生交替性变化，并且，各时期样品中优势菌群各不相同。腌制期由于腊肉基质中渗透压（氯化钠浓度）的变化使得此时期主要以耐盐细菌为主，由图2可以看出，腌制中期主要为Corynebacterium、Macrococcus、Faecalibacterium、Claudia、Oscillospira、Ruminococcus、Chryseobacterium；腌制后期主要以Micrococcaceae、Arthrobacter、Streptococcus、Staphylococcus为主。风干期至成品期最主要的变化是由于水分活度的变化，到成品期时水分活度为0.831，此时细菌主要为耐低水分活度的微生物以及不同类型微生物代谢产物形成相互抑制，使复杂的细菌群组得到进一步优化与组合，因此，风干期以Planococcus、Amycolatopsis、Flavobacterium、Erwinia、Planomicrobium为主。

2.3 基因功能预测

表3 PICRUSt代谢功能预测分析Table 3 Metabolic function prediction with PICRUSt

PICRUSt软件用于预测样品中存在细菌的功能基因及其代谢途径。陇西腊肉样品中涉及代谢途径有：氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、碳水化合物代谢、能量代谢、酶家族、聚糖生物合成与代谢、脂肪代谢、辅助因子和维生素的代谢、其他氨基酸代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、核苷酸代谢、异种生物的生物降解和代谢（表3）。其中，平均基因丰度最高的代谢通路为氨基酸代谢（11.19%），其次，分别为碳水化和物代谢（9.46%）、能量代谢（5.77%）、辅助因子和维生素代谢（4.36%）和脂肪代谢（4.17%），说明陇西腊肉制作过程中细菌参与了主要营养素的代谢以及能量的合成，这些代谢产物的积累是腊肉风味形成的基础。也有部分细菌参与了脂肪代谢，这从基因层面直接揭示了细菌与脂肪代谢的相关性。

2.4 优势细菌对腊肉脂肪氧化的影响

图3 陇西腊肉制作过程中酸价（A）和过氧化值（B）的变化Fig.3 Changes in AV (A) and POV (B) during the production of Longxi bacon

酸价可以间接反映脂肪中游离脂肪酸的含量，试样中的游离脂肪酸主要来自脂肪的水解以及脂肪氧化产生的小分子脂肪酸。从图3可以看出，陇西腊肉制作过程中酸价逐渐升高，酸价（以KOH计）由T0样品0.36 mg/kg逐渐增加至T90样品1.23 mg/kg，比原料肉中酸价增加了2.4 倍。说明随着制作时间的延长脂肪逐渐发生水解，脂肪酸积累导致酸价升高。

过氧化值是反映脂肪氧化程度的参数，是不饱和脂肪酸中双键与空气中氧气结合产物的量化指标，过氧化值高表明脂肪氧化的中间产物积累多。从图3可以看出，在传统陇西腊肉加工过程中，过氧化值逐渐升高，由T0样品0.015 g/100 g增加至T90样品0.034 g/100 g，比原料肉增加了97%。说明脂肪的氧化产物不断累积。这可能是由于肉胚中乳酸菌和葡萄球菌代谢活动所致。研究证实Staphylococcus、Lactobacillus分泌丰富的酶系加速脂肪氧化，从而使得肉样过氧化值升高[34-35]。另外，游离脂肪酸的积累也能促进脂肪氧化使得过氧化值升高[36]。

2.5 陇西腊肉制作过程中游离脂肪酸的变化

如表4所示，陇西腊肉中的脂肪酸主要由棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸组成，且各时期相对含量有所不同，总占比83.84%～92.43%。游离脂肪酸中棕榈酸、油酸、亚油酸能在后续加工贮藏过程中产生重要的挥发性物质，亚油酸氧化能产生2-戊基呋喃和2-庚酮等物质，且2-戊基呋喃是具有类火腿香型的挥发性物质[37-38]。

表4 陇西腊肉制作过程中游离脂肪酸的变化Table 4 Changes in free fatty acids during the production of Longxi bacon

整个制作过程中占饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）总含量最高的为硬脂酸和棕榈酸。其中，硬脂酸在原料肉中（T0样品）相对含量为9.75%，随后相对含量逐渐升高，至成品肉（T90样品）时高达12.7%。棕榈酸在原料肉（T0）中相对含量最高（25.41%），之后逐渐降低。

值得注意的是，单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）占脂肪酸总含量比例最高。整个制作过程中样品MUFA含量最高为棕榈油酸、油酸，其中，棕榈油酸在原料肉（T0样品）相对含量最高（7.5%），随后逐渐降低；油酸在T30样品中相对含量最高（40.46%）。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）中亚油酸所占比例最大，并且呈逐渐升高趋势，在成品肉中相对含量达到最高（14.62%）。

此外，陇西腊肉制作过程中原料肉至成品肉中ΣSFA所占比例在35.24%～39.8%之间，至成品肉时有所减少（减少8.6%），并且ΣMUFA相对含量较原料肉降低了10.34%，说明细菌参与下发生氧化降解，这也是制作过程中过氧化值上升的主要原因（图3B）。不饱和脂肪酸（ΣPUFA+ΣMUFA）所占比例在55.14%～61.68%之间，尤其成品期ΣPUFA相对含量较原料肉增加了46%，说明PUFA是酸价上升的主要原因（图3A）。各时期样品中ΣPUFA/ΣSFA值在0.291～0.505之间（表4），成品肉时为0.465，较原料肉（0.291）有所增加，营养学家认为ΣPUFA/ΣSFA比值在0.4以上则肉品中脂肪酸组成较为均衡[39]，很明显陇西腊肉脂肪酸组成满足此条件。另外，饮食富含PUFA可以降低血液中的胆固醇水平[40]。

2.6 优势菌群与游离脂肪酸的相关性分析

表5 优势菌群与脂肪酸之间的相关性分析Table 5 Correlation analysis between dominant bacteria and fatty acids in Longxi bacon

选取陇西腊肉制作过程中的主要脂肪酸与优势细菌属进行相关性分析，结果如表5所示。主要脂肪酸含量变化与大部分优势菌群呈显著相关性，仅有少数菌群正、负相关性不明显。陇西腊肉制作过程中与SFA相关的菌群主要是Lactobacillus、Streptococcus。其中，硬脂酸与Streptococcus丰度变化极显著相关（P＜0.01），与Lactobacillus显著相关（P＜0.05），棕榈酸与Streptococcus显著相关（P＜0.05）。Lactobacillus通过分泌脂酶加速脂肪降解，有利于硬脂酸的积累，而Streptococcus可能促进了棕榈酸的氧化导致其在成品肉中含量有所下降[41]。MUFA总量与Streptococcus显著相关（P＜0.05）。其中，棕榈油酸与Carnobacterium显著相关（P＜0.05），Staphylococcus极显著相关（P＜0.01）。Carnobacterium[42]、Staphylococcus[34,43]同样能分泌脂酶，这可能是造成棕榈油酸氧化的原因，Staphylococcus作用更明显。油酸与Brochothrix显著相关（P＜0.05），Brochothrix[44]是肉品常见腐败菌，说明Brochothrix可能主要通过油酸造成脂肪氧化酸败导致肉品腐败。PUFA总量与Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus丰度变化显著相关（P＜0.05）。其中，亚油酸与Staphylococcus、Cupriavidus、Carnobacterium丰度变化显著相关（P＜0.05），说明这些菌群有能促进亚油酸的生成与积累[45]。

综上，通过明晰优势菌群与主要脂肪酸变化的相关性，有助于进一步通过定向调整或控制陇西腊肉制作过程中的工艺参数（如氯化钠添加量、通风时间、环境温度等）以提升腊肉品质，进而为腊肉风味形成提供理论依据。

3 结 论

本研究表明陇西腊肉制作过程中菌群演替存在明显的时间异质性，传统制作工序变化（腌制、自然风干）是优势菌群Brochothrix、Carnobacterium、Lactobacillus、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Cupriavidus演替的驱动力；脂肪代谢通路从基因层面直接揭示细菌参与了脂肪代谢；棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸是陇西腊肉中主要脂肪酸，总占比83.84%～92.43%；陇西腊肉制作过程脂肪酸变化与优势细菌属具有明显相关性，Streptococcus、Staphylococcus、Lactobacillus、Cupriavidus、Carnobacterium、Brochothrix是参与脂肪代谢主要菌群；在此期间，Streptococcus、Lactobacillus主要参与SFA、PUFA的形成与转化，Carnobacterium、Staphylococcus、Brochothrix、Cupriavidus主要参与了不饱和脂肪酸代谢，并与棕榈油酸、油酸、亚油酸含量的变化密切相关；不饱和脂肪酸氧化可能是酸价、过氧化值上升的主要原因，优势菌群主要通过不饱和脂肪酸的变化干预脂肪氧化。研究揭示了陇西腊肉制作过程中细菌群落演替与脂肪水解及氧化规律，为其品质提升以及传统制作工艺向现代化转变提供理论支撑。