基于高通量测序的窖泥原核微生物群落多样性在退化窖池中的空间异质性

胡晓龙，余 苗，曹振华，王康丽，田瑞杰，韩素娜，李 华，李建民，曾 田，李 红

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；2.河南宋河酒业股份有限公司，河南 鹿邑 477200；3.河南仰韶酒业有限公司博士后研发基地，河南 渑池 472000；4.五粮液集团有限公司，四川 宜宾 644000）

中国浓香型白酒是我国四大基本香型（浓、酱、清、米）之一，其绵甜爽净和窖香浓郁为主的独特风格，深受国人青睐。窖泥是浓香型白酒生产的重要微生物来源之一，其微生物群落α及β多样性是决定窖泥质量优劣（老熟或退化）及白酒品质的主要内因[1-3]，因此，窖泥微生物一直是国内学者研究的热点和重点。

近年来，随着高通量测序等分子生物学手段在窖泥研究中的广泛应用，不同时间（窖龄）、空间（产区之间及窖池内部）及质量等级（退化、正常及优质）窖泥的微生物群落α及β多样性、理化性质以及两者之间的相关性越来越清晰。其中窖泥物种多样性（Shannon指数）及丰度（Chao1指数）随窖泥窖龄（≤25 a）[4]、质量[1-2,5]及窖池深度（窖壁和窖底）[6]增加整体上呈上升趋势。窖泥微生物群落β多样性研究表明，我国十余个浓香型白酒主产区（四川、河南等）窖泥中的优势微生物主要包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、广古菌门（Euryarchaeota）、互养菌门（Synergistetes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi），但其组成因窖泥窖龄、质量及窖池空间位置及地域不同而呈现差异[1,6-14]。例如，随着窖龄和质量增加，Firmicutes呈下降趋势，而Bacteroidetes和Euryarchaeota呈增加趋势[1,4]；四川与安徽两个产区窖泥的优势古菌种类不尽相同[14]；新窖窖底泥Bacteroidetes含量高于新窖窖壁泥[6]。Hu Xiaolong等[1]研究指出窖泥中菌群网络枢纽主要隶属于梭菌纲（Clostridia）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和甲烷微菌纲（Methanomicrobia），与乳酸菌属（Lactobacillus、Pediococcus和Streptococcus）呈极显著负相关。窖泥理化性质是影响窖泥微生物群落的主要因素，如含水量、pH值、铵态氮及有效磷与微生物群落结构显著相关，且被推荐为用于初步判断窖泥质量或老熟程度的简便指标[1,4,6,15]。

如前所述，窖泥退化作为窖泥研究的热点之一，其微生物群落及理化特征已经较为清晰[1-2]。但是窖泥原核微生物群落α和β多样性在退化窖池中的空间分布规律、退化程度与窖池空间位置的关联性等鲜见报道。因此，本研究以退化窖池为对象，采用高通量测序技术结合多元统计分析方法解析退化窖池中窖壁上、中、下层及窖底窖泥中原核微生物群落多样性及其空间分布规律，找出影响微生物群落的生物和理化因素，以期为深入揭示窖泥退化机理、预防窖泥退化及定向提升窖泥质量技术的开发提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖泥样品由河南某知名浓香型白酒企业（WGC酒业）提供，窖龄30 a。

氢氧化钠、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、浓硫酸、盐酸国药集团化学试剂有限公司；重铬酸钾、酒石酸钾钠、亚硝基铁氰化钾、高氯酸钠、氯化铵、酒石酸锑钾北京北化精细化学品有限责任公司；钼酸铵 上海源叶生物科技有限公司；氟化铵、硼酸 上海麦克林生化科技有限公司；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV BlueStar A紫外分光光度计 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；TGL-20M高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；MP200A精密电子天平 上海良丰仪器仪表有限公司；101-1电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司；DF-1集热式恒温磁力搅拌锅 金坛市中大仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 窖泥样品采集

根据退化窖泥的感官特征（黄色、窖泥松散干燥、酯香和酒香弱等）选取退化窖池[1,15]。本研究随机选取两口窖龄30 a的退化窖池，每口退化窖池选取窖壁上的两个（T1和T2）上层窖泥样品，混合后作为该窖池的上层（PW-T）代表样；选取窖壁中层M1和M2混合样品作为中层（PW-M）代表样；选取窖壁下层U1和U2混合样品作为下层（PW-U）代表样；选取窖底B1和B2混合样品作为窖底泥（PB）代表样（图1），共计8 个代表样品。每份混合样品采集300 g，于-80 ℃保存备用。

图1 窖泥取样位置Fig.1 Sampling locations of pit muds in the fermentation pit for Chinese strong-flavor Baijiu

1.3.2 理化指标测定

参照李俊辉等[12]的烘干法和电位法分别测定窖泥含水量及pH值。采用酸、碱中和法滴定法测定总酸含量[16]。采用重铬酸钾氧化分光光度法测定乙醇含量[17]。采用靛酚蓝比色法测定窖泥中铵态氮含量[18]。参照NY/T 1121.7—2014《土壤检测第7部分 土壤有效磷的测定》测定窖泥中有效磷含量。

1.3.3 窖泥宏基因组提取及Illumina MiSeq测序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit试剂盒并参照说明书对窖泥样品总DNA进行提取，然后用Qubit 2.0荧光定量仪测定其浓度和纯度。将合格的DNA委托苏州金唯智生物科技有限公司完成建库及Illumina MiSeq双端测序。其中16S rDNA扩增子引物对为F（5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′）和R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′），扩增区域为16S rDNA的V3-V4区。

1.4 数据分析

采用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）及Qiime（1.9.1）软件对高通量测序序列进行质控，包括序列拼接，以及去除含有N的序列、引物和接头、质量值低于20的碱基、长度低于200 bp的序列及嵌合体序列得到有效序列。使用VSEARCH（1.9.6）将有效序列进行聚类，其中相似性不低于97%的序列归为1 个可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）。然后利用贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽平的方法，分别计算Shannon、Chao1等α多样性指数反映群落的物种丰度和多样性。采用HemI软件绘制热图；采用软件Canoco 5绘制冗余分析图谱；采用SPSS 20软件（IBM Corp., Armonk, NY）完成Pearson和Spearman相关分析。本研究挑选平均含量超过0.1%属用于Spearman相关分析，共35 个属，占每个样品的83.9%～99.8%，表明其涵盖了每个样品中大部分微生物信息。将Spearman相关系数ρ≥0.8或ρ≤-0.8且呈极显著相关（P＜0.01）的属采用Gephi进行可视化网络分析。

2 结果与分析

2.1 退化窖池不同位置窖泥原核微生物群落α多样性分析

经序列质控，共得到478 518 条有效序列，平均长度为457 bp，每个窖泥样品序列数在49 625～68 972 条之间，其中PW-U序列数量最多，PB最少，但其在不同位置窖泥之间不存在显著差异（P＜0.05，表1）。窖泥样品物种丰度（Observed OTU和Chao1指数）、多样性（Shannon指数）及均匀度（Simpson指数）大小依次为PW-U或PB＞PW-M＞PW-T（P＜0.05，表1），表明窖泥原核微生物群落α多样性存在显著的空间异质性，且随着窖池深度增加呈显著增加趋势。其中Shannon指数与窖泥质量呈正相关，能很好地反映窖泥老熟和退化程度[1,5-6,19]。由表1可知，所有窖泥原核微生物群落Shannon指数在0.33～3.38之间，远低于已报道同样基于高通量测序得到的优质及老熟窖泥（5.5～6.45）[1,5-6,19]，说明窖池整体出现了退化。Shannon指数由大到小依次为PW-U＞PB＞PW-M＞PW-T（P＜0.05），反映窖泥退化严重程度PW-T＞PW-M＞PB＞PW-U，这也与窖池中窖泥自上而下退化的生产实践一致。其中上层退化最为严重，这主要是由于上层窖泥最易受酒醅下沉或开窖影响[3]，暴露于空气频次高，水分散失大，导致其含水量下降快且厌氧微生物种类及含量减少，进而导致窖泥微生物物种多样性下降。

表1 退化窖池中不同位置窖泥样品原核微生物群落α多样性及其理化性质Table 1 α-Diversity index of prokaryotic microbial community and physicochemical properties of pit muds from different locations of degraded pit

2.2 退化窖池不同位置窖泥的理化因子分析

由表1可以看出，窖泥理化因子可以分为两大类，一类是不随窖泥空间位置改变而呈显著差异的因子（P＜0.05），包括乙醇、总酸及铵态氮。其中铵态氮含量与窖泥质量及窖龄呈正相关，与酸含量呈负相关[1,4,15,20]，PW-T窖泥铵态氮含量最低且总酸含量最高（表1），再次表明PW-T窖泥退化最为严重，与上述微生物群落α多样性结果一致。一类是在退化窖池不同空间位置呈显著差异（P＜0.05）的因子，包括含水量（27.95%～38.70%，平均值32.7%）、pH值（3.92～4.88，平均值4.42）及有效磷含量（114.60～338.92 mg/kg，平均值259.27 mg/kg），几乎均远低于已报道的优质窖泥及老熟（≥25 a）窖泥的含水量（38.1%～45.3%）、pH值（4.8～7.5）及有效磷含量（0.5～10 g/kg）[2,4,10,15,21]，符合退化窖泥低含水量、低pH值及低有效磷的“三低”理化特征[3,15]。其中PW-U窖泥含水量及pH值显著高于其他位置，表明PW-U退化程度最低。但是，窖池其他位置（如PW-T和PW-M）窖泥之间的理化性质（如含水量和pH值）没有显著差异，与能灵敏地反映出窖池空间异质性，以及窖泥退化或者老熟程度的微生物指标（如Shannon指数）相比，理化指标的变化具有滞后性。

2.3 退化窖池不同位置窖泥微生物群落β多样性分析

2.3.1 窖泥微生物群落组成门/纲水平分析

基于OTU注释，共得到12 个门，其中11 个细菌门，1 个古菌门。共发现6 个优势（所有窖泥样品中平均相对含量＞0.1%）菌门（图2a），由高到低依次为Firmicutes（88.1%）＞Bacteroidetes（6.2%）＞Proteobacteria（3.9%）＞Euryarchaeota（0.8%）＞Actinobacteria（0.5%）＞Synergistetes（0.4%），其占每个样品的99%以上。与我国南方和北方十余个浓香型白酒主产区窖泥中的优势菌门种类基本没有地域性差异[1,6-13]，这可能与我国窖泥具有高酸度、高乙醇、微氧和高水分等共性特征有关[22]。随着窖池深度增加，窖泥优势菌门由单一的Firmicutes（PW-T和PW-M），逐渐变为6 个菌门（PW-U）和4 个菌门（PB）；Firmicutes呈下降趋势，其他优势菌门呈不同程度的增加。其中PW-T、PW-M及PB中Bacteroidetes（0.03%～1.3%）和Euryarchaeota（0%～0.05%）相对含量均很低，与已报道的退化窖泥原核微生物群落结构更为接近[1]，而PW-U与老熟窖泥及优质窖泥存在一定的相似度，再次表明了本研究中的PW-U窖泥退化速度最慢。

在纲水平，共检测到20 个可鉴定的纲及未分类的纲，共包括Clostridia、Bacteroidia及γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）等10 个优势菌纲（所有窖泥样品中平均相对含量高于0.1%，图2b），其在每个样品的总相对含量均高达99%以上。随着窖池深度增加，窖泥优势菌纲数量呈增加趋势，PW-U（8 种）＞PB（6 种）＞PW-M（4 种）＞PW-T（2 种）；结构上，芽孢杆菌纲（Bacilli）呈下降趋势，其余9 种优势菌纲含量均呈增加趋势，尤其是Clostrdia和Bacteroidia增长明显，分别占PW-U窖泥的52.9%和23.1%。此外，甲烷菌含量的升高是判定窖泥老熟的重要指标[1,6]，不同位置甲烷菌（Methanobacteria及Methanomicrobia）总相对含量为PW-U（2.94%）＞PB（0.06%）＞PW-M（0.04%）＞PW-T（0.005%）；Clostrdia和Bacteroidia相对含量一般随着窖泥的窖龄和质量增加而增加[1,4,7,19,23]，其总相对含量大小顺序为PW-U（75.9%）＞PB（20.3%）＞PW-M（20.2%）＞PW-T（2.3%），这也在一定程度上反映了不同位置窖泥的退化程度，即PW-T＞PW-M＞PW-U和PB。

群落β多样性研究结果表明窖泥微生物群落组成在退化窖池中具有明显的空间异质性；且窖池上部退化程度比窖池下部严重，与前面窖泥微生物群落α多样性及其理化分析结果吻合。

2.3.2 窖泥微生物群落组成属水平分析

所有窖泥中共检测到149 个可鉴定属及未分类的属，可鉴定属在各位置样品中的相对含量分别为99.98%（PW-T）、96.20%（PW-M）、89.02%（PW-U）及99.01%（PB），其中PW-U未分类属相对含量最多为10.98%，这也表明该位置窖泥微生物复杂性可能更高[6]。Venn分析表明窖池中每个位置特有属数量及其总相对含量分别为31 个和4.91%（PW-U）、21 个和0.56%（PB）、1 个和0.004%（PW-M）、1 个和0.003%（PW-T），表明PW-M和PW-T窖泥在退化过程中物种及含量最容易消失和减少，其物种几乎均可在PW-U和PB窖泥中找到（图3a）。此外，尽管PW-U（44 个）和PB（35 个）均存在数量较多的特有物种，但其含量仅分别占相应窖泥的5.29%和1.05%（图3b），表明共有属是两类样品的主体微生物（平均相对含量＞94%）。

图3 不同位置窖泥样品（a）及PW-U与PB（b）中属水平Venn图Fig.3 Venn diagram showing unique and shared microbial community compositon between pit muds from different positions of the pit (a) and between PW-U and PB (b)

为了进一步分析原核微生物群落在退化窖池中的空间异质性，选取每个窖泥中含量前10的属进行热图分析，共33 个属，其占PW-U的80.7%，占其他窖泥的93.7%～99.9%，再次反映了PW-U窖泥微生物菌群复杂性最高[6]。上述33 个属分别隶属于7 个纲，且主要集中在Bacilli（67.6%）、Clostridia（17.4%）、Bacteroidia（5.7%）和Gammaproteobacteria（1.0%）4 个纲（图4）。其中乳杆菌属（Lactobacillus，66.9%）＞己酸菌属（Caproiciproducens，11.7%）＞嗜蛋白菌属（Proteiniphilum，3.1%）＞梭菌属（Clostridiumsensu stricto12，1.1%）＞佩特里单胞菌属（Petrimonas，1.1%）为窖泥中的优势属，尽管与已报道的四川、安徽等浓香型白酒产区窖泥的优势属种类一致性较高，但组成差异较大[4,6,8,24]。

图4 所有窖泥样品中含量前10属热图分析Fig.4 Heatmap analysis of the top 10 more dominant microbial genera in all pit mud samples

由图4可知，不同位置的窖泥样品清晰地聚成I和II两个大簇，其中PW-U单独聚为一簇（II），第I簇又可清晰地分为3 个亚簇，即PW-T、PW-M和PB，再次表明退化窖池中微生物群落具有明显的空间异质性。单因素方差分析结果表明，Lactobacillus相对含量PW-T（97.7%）＞PB（71.7%）＞PW-U（18.7%）（P＜0.05），PW-M介于PW-T和PB之间，但无显著差异（P＞0.05）。而Caproiciproducens相对含量PW-U（28.8%）＞PW-M（14.3%）＞PB（3.4%）和PW-T（0.1%）（P＜0.05）。Proteiniphilum和Petrimonas相对含量PW-U（11.92%和4.19%）＞PB（0.38%和0.14%）＞PW-M（0.14%和0.11%）＞PW-T（0.09%和0.04%）。汇总文献可知[1,2,4,8,14,24-25]，Lactobacillus是新窖泥（≤1 a）及退化窖泥中第一优势属（≥55%），在老窖（≥20 a）、正常及优质窖泥中其含量相对较低（＜14%）；Clostridium和Caproiciproducens一般在老窖泥含量较高；Proteiniphilum和Petrimonas是一类能产乙酸的细菌，能与标志窖泥老熟的甲烷菌共生。综上，窖池下部（PW-U和PB）窖泥较窖池上部窖泥更为接近老窖及优质窖泥微生物群落组成，尤其PW-U，再次表明了窖池退化整体上是一个自上而下的过程。但PB退化程度高于PW-U，这可能是由于PB含水量（27.95%）显著低于PW-U窖泥（38.7%，表1）导致，因为含水量与窖泥老熟可能呈显著正相关[6]。

2.4 退化窖池微生物群落相关性网络分析

图5 窖泥样品中基于相对含量≥0.1%属的同现相关（a）及负相关（b）网络图Fig.5 Co-occurrence network (a) and negative correlation network (b)analysis for genera accounting for higher than 0.1% in pit muds

由图5a可知，同现（正相关）网络图中共有32 个节点（实心圆点，每个节点代表一个属），127 条边（两个节点之间的连线，粗细程度代表相关性强弱）。所有节点分别隶属于8 个可鉴定纲及1 个unclassified，主要集中在Clostridia（占总节点数量50%）、Bacteroidia（18.75%）、Gammaproteobacteria（9.38%）及Methanobacteria（6.25%）。同现网络的相关性主要为纲间微生物相关性（78.74%），纲内相关性仅占21.26%，表明物种多样性低可能是导致窖泥菌群网络失衡的主要原因。

同现网络共存在9 个枢纽（多于11 条边的节点为枢纽），分别为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、Proteiniphilum、沉积菌属（Sedimentibacter）、泰氏菌属（Tissierella）、氨基杆菌属（Aminobacterium）、Petrimonas、黏胶微菌属（Lentimicrobium）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）和互营单胞菌属（Syntrophomonas）（图5a），其分别隶属于Methanomicrobia（1 个）、Bacteroidia（3 个）、Clostridia（3 个）、Synergistia（1 个）和Methanobacteria（1 个）5 个纲。枢纽总含量随着窖池深度增加呈上升趋势，即PW-T（0.00%）＜PW-M（0.05%）＜PB（0.14%）＜PW-U（2.84%），但远低于其在已报道的老窖（如仅Petrimonas一个属相对含量就高于11.1%）[4]及优质窖泥（如仅Methanosarcina一个属相对含量就高于4.2%）[1]中的含量。同时同现网络中出现了两个独立的模块（图5a），这可能是由于能链接两个模块的节点或枢纽含量极少或消失，如缺少能链接假单胞菌属（Pseudomonas）的鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）节点[1]，表明了整个窖池处于退化状态，且退化程度由强到弱为PW-T＞PW-M＞PB＞PW-U。这主要是由于枢纽是影响整个环境微生物菌群网络的重要因素，其种类及含量的减少将会导致整个菌群网络碎片化[26-27]，进而导致窖泥微生态稳定性变差和窖泥菌群退化。

负相关网络中，共15 个节点隶属于7 个纲，13 条边。负相关网络同样是纲间相关性（92.31%）大于纲内相关性（7.69%）。由图5b可以看出，窖泥中呈负相关的微生物主要发生在Lactobacillus属与其他属之间，且与正相关网络中多数枢纽呈现负相关，这与Hu Xiaolong[1]和Wang Xueshan[7]等研究结果一致。这主要是由于：1）Lactobacillus代谢物乳酸大量积累造成窖泥pH值下降，进而导致窖泥中包括正相关网络枢纽在内的大量微生物（多数最适生长pH值为近中性）减少甚至消失[28-30]；2）其代谢的Nisin、Lactacin及Pediocin等抑菌素能抑制Clostridia及Bacillus等革兰氏阳性细菌的生长繁殖[1,19]。因此，推测Lactobacillus含量激增是加速窖泥微生物群落失衡、菌群鲁棒性降低及窖泥退化的主要生物原因。

2.5 退化窖池微生物群落与理化因子之间相关性分析

图6 微生物群落与理化因子之间相关性分析Fig.6 Correlation analysis between microbial community and physicochemical factors

冗余分析展示了窖泥微生物群落β多样性与理化因子之间的关系，图6a中2 个主成分的总解释度81%，主要集中在Axis1（60.1%）。理化因子对两者之间相关性解释度由大到小依次为含水量（51.4%）＞有效磷（16.4%）＞pH值（9.8%）＞总酸（6.6%）＞铵态氮（4.0%）＞乙醇含量（2.3%），其中含水量与微生物群落结构呈极显著关系（P＜0.01），这与张会敏等[6]研究结果一致。不同位置窖泥能被有效区分（图6a），再次说明退化窖池中微生物群落具有明显的空间异质性。以Axis1轴0点垂直线为界，仅退化程度最低的PW-U在右侧，与含水量、有效磷、pH值及铵态氮呈较强的正相关；而退化明显的PW-T、PW-M和PB在左侧，与总酸和乙醇呈较强的正相关，表明含水量、有效磷、pH值及铵态氮是促进窖泥老熟及质量提升的主要驱动力，这主要是由于含水量过低将会导致窖泥中微生物能利用的自由水下降[6]、作为速效营养物质的有效磷及铵态氮减少[15,31]，以及pH值降低均会影响窖泥微生物的生长繁殖[1]，进而导致窖泥微生物群落失衡、鲁棒性降低，加速窖泥退化。

Pearson相关性分析表明窖泥理化因子与其微生物群落α多样性之间存在显著相关性（P＜0.05），但仅存在于pH值与Simpson指数之间（图6b）。与之前报道的研究结果存在一定的异同性，如pH值与Shannon指数之间存在显著相关性在本研究中未发现[1]，这可能是由于本研究所取窖泥样品均处在退化阶段，其pH（3.92～4.88）与Shannon指数（0.33～3.38）的跨度小且数值较低，在此范围内两者相关性不显著。理化因子之间Pearson相关性分析结果表明，pH值与多种理化因子均呈显著正（铵态氮）、负（总酸和乙醇）相关性，尤其是铵态氮，表明pH值可以作为一个综合指标反映窖泥整体的理化特征，这与胡晓龙[19]及Pietri等[32]的研究结果一致。

表2 窖泥理化因子与同现性网络枢纽Pearson相关性分析Table 2 Pearson correlation analysis between physicochemical factors and hubs of co-occurrence network of pit muds

如前所述，同现网络中的枢纽（共9 个属）是维持窖泥微生物菌群结构稳定的主要因素（图5），且集中Clostridia和Bacteroidia，其与窖泥理化因子相关性见表2。上述枢纽中的5 个和7 个分别与窖泥pH值和含水量呈显著（P＜0.05）或极显著正相关（P＜0.01），这也与之前报道的结果相似[1,6]，如pH值与Clostridia和Bacteroidia呈正相关。但上述枢纽与其他理化因子的正、负相关性均不显著，例如，总酸和乙醇与6 个枢纽呈负相关，有效磷与所有枢纽呈正相关（P＞0.05）。尽管这种相关性在退化窖泥样品不显著，但其相关性的正、负状态与已有报道一致，如有效磷与Methanobacteria中的属呈显著正相关性[1]。综上，通过明晰菌群网络枢纽与理化因子相关性，有助于为进一步通过定向调整或控制窖泥的理化因子（如含水量、pH值等）以提升退化窖泥中枢纽属的含量，进而为窖泥微生物菌群的稳定提供理论依据。

3 结 论

本研究结果表明窖泥微生物群落多样性在供试退化窖池中存在明显的空间异质性，主要结果或结论有：1）窖池退化是一个自上而下的退化过程；2）微生物群落α多样性指数（如Shannon指数等）能灵敏地反映窖泥退化程度及其在窖池中的空间异质性，其随窖池的深度增加呈显著上升趋势，但其在PB的值显著低于PW-U窖泥；3）退化窖池窖泥理化因子具有低pH值、低含水量及低有效磷的“三低”特征，但其随窖池深度增加的变化规律不明显，表明其反映窖泥退化程度具有滞后性；4）微生物群落β多样性具有明显的窖池空间异质性，且窖池下部（PB及PW-U）窖泥的微生物物种几乎全部涵盖了上部（PW-T和PW-M）窖泥的所有物种；5）退化窖池窖泥中作为菌群正相关网络枢纽的属总含量很低，主要集中在Clostridia和Bacteroidia，推测Lactobacillus激增是打破窖泥菌群网络平衡的主要微生物；6）含水量及pH值是影响窖泥微生物群落结构主要驱动力，其与菌群网络枢纽呈显著的正相关；7）窖泥pH值与多种理化因子呈现显著的相关性，且与菌群α多样性Simpson指数呈现显著的正相关，表明pH值作为一个综合的指标可用于窖泥质量的初步判断。