应用CRISPR/Cas13a快速鉴定布鲁氏菌

黄明耀，梁文立，吴婉婷，刘 足，谢淑媚，邓颖颖，傅俊方，姜长宏，龙 军，江凌晓

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称“布病”，是一种具有传染性的人兽共患病，由布鲁氏菌引起。临床鉴定布鲁氏菌的方法主要有需氧血培养和血清学检测，其中培养是金标准。当临床发现不明原因发热的患者时，通常抽取10 mL静脉血到血培养瓶进行培养，血培养报阳后转至血平板继续培养16～24 h，通过质谱仪或微生物鉴定系统进行鉴定，至少需要18～48 h，而且在平板培养观察以及调制菌悬液的过程中易产生气溶胶，存在实验室感染风险。本研究拟建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法，该方法可以对需氧血培养阳性培养物中存在的布鲁氏菌进行快速准确鉴定。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验菌株 布鲁氏菌64株(由广东省CDC提取DNA后提供，菌株均分离自临床患者全血培养物)，包括羊种布鲁氏菌27株、猪种布鲁氏菌7株、牛种布鲁氏菌1株和未知亚种布鲁氏菌29株。

非布鲁氏菌56株：包括革兰阴性杆菌28株(沙门氏菌2株、大肠埃希菌5株、阴沟肠杆菌1株、产气肠杆菌1株、肺炎克雷伯氏菌3株、产酸克雷伯菌1株、鲍曼不动杆菌5株、铜绿假单胞菌3株、粘质沙雷氏菌2株、琼氏不动杆菌1株、嗜麦芽窄食单胞菌1株、嗜水/豚鼠气单胞菌1株、脑膜败血伊丽莎白金菌1株、皮氏罗尔斯顿菌1株)、革兰阳性球菌24株(无乳链球菌2株、化脓链球菌1株、星座链球菌1株、咽峡链球菌1株、表皮葡萄球菌2株、金黄色葡萄球菌3株、缓慢葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌2株、头部葡萄球菌2株、人葡萄球菌2株、粪肠球菌4株、屎肠球菌1株、苛养颗粒链菌1株、胶粘罗斯菌1株)、革兰阳性杆菌1株(非发酵棒状杆菌1株)、真菌1株(红曲霉1株)以及和布鲁氏菌亲缘关系相近的人苍白杆菌1株和流感嗜血杆菌1株[1-2]。以上菌株均经过VITEK 2或VITEK MS鉴定，并由本室保存。

1.1.2人类DNA 人类DNA购自索莱宝科技有限公司(中国北京)。

1.1.3临床样本 临床收集的57例成人需氧阳性血培养瓶，包括55例静脉血培养的培养瓶和2例关节积液培养的培养瓶，来自41个患者。其中36例报阳时间≥2.0 d，21例报阳时间为1.5～2.0 d。

1.1.4引物、crRNA和ssRNA 正向引物BCSP31-F6(5′→3′)：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGCTCTGGAGTCCGGCTTTACGC-AGTC-3′。反向引物BCSP31-R6(3′→5′)：3′-GACCGATTTGATGTTTGCATCCTTACGCGC-AACGA-5′。crRNA：5′-GGGGAUUUAGACUA-CCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGGU-AAAGCGUCGCCAGAAGGCGCAAAUC-3′。ssRNA探针：5′-6-FAM-UUUUUC-BHQ1。

1.1.5Cas13a蛋白 Cas13a的开放阅读框(open reading frame, ORF)是优化密码子后合成的，然后将Cas13a ORF克隆到表达载体Pc013中，并转染到大肠杆菌BL21中。大肠杆菌BL21首先在37 ℃下生长，然后与IPTG在16 ℃下孵育。再使用Ni-NTA方法从裂解细菌中纯化蛋白，将纯化蛋白样本等分保存在-80 ℃下[3]。其他试剂如重组酶聚合酶、NTP、Buffer A和Buffer B等购自生工生物工程股份有限公司(中国上海)。

1.1.6仪器 Real-Time PCR仪Gentier 48E购自天隆科技有限公司(中国西安)。

1.2方 法

1.2.1阳性血培养瓶处理 用注射器抽取符合时间要求的需氧阳性血培养瓶菌液1.2 mL，其中0.1 mL(约2滴)接种至血平板，常规培养16～24 h，进行VITEK 2或VITEK MS鉴定；剩余菌液转移至1.5 mL EP管中，100 ℃ 30 min灭活，以3 000 r/min离心3 min后取500 μL上清菌液，存-20 ℃备用。

1.2.2 核酸提取

1.2.2.1实验菌株核酸提取 将冻存的56株非布鲁氏菌菌株复苏，分别接种至血平板，培养16～24 h后取单个菌落，用1 mL生理盐水洗脱至1.5 mL EP管中。随后再将菌液以13 000 r/min离心10 min，弃上清余下50 μL沉淀。震荡混匀后100 ℃ 10 min，再次13 000 r/min离心10 min，取2.5 μL的上清液作为CRISPR/Cas13a-Brucella模板。

1.2.2.2阳性血培养瓶冻存菌液核酸提取 -20 ℃冻存上清菌液500 μL，13 000 r/min离心10 min，弃上清余下50 μL沉淀。震荡混匀后100 ℃ 10 min，再次13 000 r/min离心10 min，取2.5 μL上清液作为CRISPR/Cas13a-Brucella模板。

1.2.3CRISPR/Cas13a-Brucella分析 CRISPR/Cas13a-Brucella分析包括重组酶聚合酶扩增(Reverse-transcription Recombinase Polymerase Amplification, RPA)、T7转录以及Cas13a检测[3]。

扩增体系(25 μL)：每个反应包含2.5 μL模板、正反引物各0.5 μL(浓度均为10 μmol/L)、20.75 μL的Buffer A、1.25 μL的Buffer B(浓度为14 mmol/L醋酸镁)和RPA酶混合物。每个反应共有25 μL混合物。

反应体系(4 μL)：每个反应包含crRNA 1 μL(浓度为33.3 nmol/L)、Cas13a蛋白1 μL(浓度为66.7 nmol/L)、0.25 μL的T7 RNA聚合酶(安诺论生物科技有限公司，北京)、1.25 μL的NTP(浓度为10 mmol/L)和ssRNA探针0.5 μL(浓度为166 nmol/L)。每个反应共有4 μL CRISPR/Cas13a反应混合物。

检测：首先将配好的扩增体系置于37 ℃恒温金属浴中孵育30 min，然后添加4 μL CRISPR/Cas13a反应混合物。即刻用PCR仪进行荧光信号检测，每分钟检测1次荧光信号，持续收集30 min荧光信号。每批实验以无核酸酶水为阴性质控NC，以0.46 ng/μL 的布鲁氏菌提纯DNA为阳性质控。

结果判读：首先根据待测样本的终点荧光值和初始荧光值计算待测样本的扩增趋势值(Amplification trend value，AT)，AT=待测样本终点荧光值/待测样本初始荧光值；然后根据待测样本终点荧光值与阴性质控NC的终点荧光值计算待测样本的荧光倍数变化值(Fluorescence multiple change value，FC)，FC=待测样本终点荧光值/NC终点荧光值。当FC≥2且AT≥2时，判断为阳性；当FC≥2而11则判为阳性；否则判断为阴性。

1.2.4检测下限(LOD)评估 布鲁氏菌纯DNA通过Qubit(Thermo Fisher，Massachusetts)测定浓度，使用以下公式计算基因组拷贝数：拷贝数=(6.02×1023)×(DNA浓度×10-9)/(DNA长度×660)。用无核酸酶的水进行10倍梯度稀释至1 fg/μL，每个滴度取2.5 μL用作模板。进行10次重复试验，评估CRISPR/Cas13a方法的检测下限。

2 结 果

2.1检测下限 梯度稀释实验结果(图1)显示本方法检测下限为10 fg/μL(约1 copy/μL)。

图1 不同浓度样本扩增曲线

2.2敏感性和特异性 根据鉴定结果判读标准，64株布鲁氏菌CRISPR/Cas13a方法鉴定为阳性，且阳性最小FC值为2.1；56株非布鲁氏菌和人DNA为阴性，阴性最大FC值是1.9，设定2.0为截断值以完全区分阳性组和阴性组(图2)。计算敏感性和特异性均为100%。

图2 从敏感性和特异性试验中获得的FC

2.3临床样本检测 57例临床需氧血培养阳性菌液以培养鉴定结果为金标准，检测结果为CRISPR/Cas13a方法的敏感性和特异性均为100%。

3 讨 论

由于畜牧业的发展和检疫制度的不健全，全球每年新增布鲁氏菌病患超过50万例[4]，在我国，布鲁氏菌病已成为近年来报告发病数上升速度最快的传染病之一[5]。人类主要通过接触被布鲁氏菌污染的动物制品而感染，被感染者可出现布鲁氏菌病的典型症状，如持续发热、出汗、疲劳和关节痛[6]。

临床常见鉴定布鲁氏菌的方法有需氧培养、血清学检测、核酸扩增试验[7]和二代测序分析，以细菌培养最常用，培养鉴定布鲁氏菌是诊断布鲁氏菌病的金标准，但是布鲁氏菌是生长缓慢的革兰阴性、需氧和兼性胞内杆菌[8]，需氧血培养瓶报阳时间通常为2.5～3.5 d，有时甚至更长，报阳后转血平板培养和鉴定至少还需要18～48 h，且存在极大的实验室感染风险，由气溶胶导致的实验室污染时有发生，严重威胁工作人员的身心健康。血清学检测也比较常用，但是该方法缺乏特异性，而且对于慢性感染、再感染、复发及反复暴露于布鲁氏菌的人群其检查结果解读较为困难，难以区分活动性感染与既往感染[5]。近年来分子诊断布鲁氏菌被认为是理想的诊断工具，核酸扩增试验敏感性和特异性较好，并且可区分急性、慢性、再感染和复发[9]，但普通荧光PCR检测方法扩增程序较复杂，所以在临床上难以推广。二代测序分析可以同时检测多种病原体，但敏感性低于普通荧光PCR，测序时间较长且依赖昂贵的设备及生信分析技术，目前主要用于鉴定疑难、危重病例样本的检测，尚不能作为常规诊断方法[10]。临床急需新的分子诊断方法，应用于布鲁氏菌的快速诊断。

自2017年张锋团队首次报道应用以CRISPR/Cas13a为基础的诊断方法检测寨卡病毒和登革病毒以来[11]，该技术展示了良好的临床应用前景。该方法的原理是以病原体基因的靶标区域设计特异的引物，对靶标区域进行RPA恒温扩增，扩增产物经过T7逆转录酶转录得到靶标RNA(target RNA)，target RNA与Cas13a-crRNA复合物的crRNA结合后激活Cas13a酶的侧切活性，切割ssRNA荧光探针[12]，利用荧光检测器检测样本荧光变化值。2019年张文宏团队也报道了应用该技术检测结核分支杆菌，并且显示与GeneXpert分析方法具有相当的敏感性[13]。为了满足临床需求，我们应用这个技术建立了快速鉴定布鲁氏菌的方法。

基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法，可以对需氧血培养阳性培养物中存在的布鲁氏菌进行快速准确鉴定，大约2 h即可完成，为患者争取早诊断、早治疗的宝贵时间。该方法也较为简便，不依赖昂贵的设备和复杂的技术，用于检测样本初始荧光值和终点荧光值的荧光PCR仪可以使用Qubit核酸定量仪替代。而且该方法鉴定布鲁氏菌时样本先经过灭菌处理，操作过程中安全性高，极大地减少实验室气溶胶感染的风险。此外，依据本实验中已知样本的鉴定结果显示，该方法鉴定布鲁氏菌的敏感性和特异性可达100%，检测下限接近10 fg/μL，且对布鲁氏菌不同生物型如羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌均可鉴定。本实验在对57份需氧血培养报阳后的菌液样本和120份纯菌落样本的鉴定中未出现假阴性和假阳性结果，但是由于受非疫区条件限制，检测样本数量有限，该方法的敏感性和特异性需要在临床实践中进行进一步验证，并且由于无法获取布鲁氏菌污染的肉类或奶制品等样本，检测该类型样本时的敏感性和特异性有待进一步评估。此外，基于CRISPR/Cas13a的鉴定方法实验室成本估计为每个样品35元，可以在工业化规模上更便宜。由于该方法复杂性很低，因此将整个测试整合到紧凑的台式仪器中进行自动进样报告分析是非常可行的。

利益冲突：无