石斛碱型生物碱及石斛碱合成生物学研究进展*

陈星月， 龚道勇，2， 郭顺星， 李 标**

(1.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193； 2.重庆大学 生物工程学院，重庆 400045)

0 引 言

生物碱类化合物是天然产物中的一类含氮呈碱性的有机小分子，多数具有结构复杂的氮杂环。现代研究发现，植物来源的生物碱在抗肿瘤方面具有良好活性[1]。现用于临床的生物碱有很多，著名的有，喜树碱：用于治疗膀胱癌、原发性肝癌和大肠癌等；长春碱：用于治疗何杰金病、非小细胞肺癌、恶性淋巴肿瘤等；山莨菪碱：应用于感染性休克和解痉挛等[2]。这些临床疗效的显著，让生物碱类天然产物的研究成为一大热点。

石斛(DendrobiumSw.)，兰科多年生附生型草本植物，具有药用和观赏两大功能，能入药的石斛大约有30种[3]，主要有效成分是生物碱类和多糖类[4]。石斛碱型生物碱是石斛所特有的一类生物碱，属于倍半萜型生物碱[5]。到目前为止，仅在6种石斛中发现了该构型的生物碱，只有31个该构型的生物碱被报道，其中金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)是拥有石斛碱型生物碱种类最多、含量最高的石斛属植物[6-7]。关于该构型生物碱的药理活性方面的研究仅集中在金钗石斛生物总碱(DNLA)和其代表性成分石斛碱(dendrobine)上。DNLA在多个方面具有活性，说明石斛碱型生物碱值得进行药理活性的研究，但这部分研究目前无法开展，原因在于除石斛碱外其他石斛碱型生物碱大多是被偶然分离，微量。考虑通过对石斛碱进行结构修饰来获得其他石斛碱型生物碱，进而对其药理活性做进一步的研究。

但目前石斛碱的获得依靠从金钗石斛中通过有机试剂提取分离纯化得到。金钗石斛野生资源已临近枯竭，目前被国家列为重点保护的珍稀濒危药用植物[8]。单靠植物获得石斛碱是不可持续的，人工合成存在诸多困难。石斛碱结构复杂，含有多个环状结构，化学全合成虽已有报道，但步骤多、条件苛刻、得率低；生物合成处在摸索阶段，仅确定了合成途径为MVA途径，以及与合成相关的7个基因，关键基因、关键步骤、关键中间体都还未被发掘。

对石斛碱型生物碱的结构组成和药理活性以及石斛碱合成生物学研究进展进行综述，并以金钗石斛的次生代谢产物作为可能中间体，结合课题组前期推测的石斛碱骨架的合成通路，推测了一条更详细的石斛碱合成通路，以期为石斛碱型生物碱下一步研究和石斛碱合成生物学的进一步推动提供参考。

1 石斛碱型生物碱

1932年，日本学者铃木秀干[9]从金钗石斛中提取分离得到了石斛属植物的第一个生物碱，并命名为石斛碱(dendrobine)。在1935年，我国科学家陈克恢[10]再次从金钗石斛中分离得到了该成分，并首次测定了其含量为0.52%。1964年，犬伏康夫[11]确定石斛碱属于倍半萜型骨架结构。随后，陆续有生物碱从石斛中分离，按其基本的骨架可分为五大构型：倍半萜型、吲哚型、吡咯烷型、邻苯二甲酰亚胺型和咪唑型[12](图1)。其中倍半萜型生物碱又叫石斛碱型生物碱。迄今为止，已报道有31个石斛碱型生物碱从9种石斛属植物中分离得到。

(a) 倍半萜型

(b) 吲哚型 (c) 邻苯二甲酰亚胺型

(d) 吡咯烷型

(e) 咪唑型

1.1 结构组成

石斛碱型生物碱的基本骨架是含有1个五元内酯环的picrotoxane型倍半萜(图1(a))，氮与picrotoxane倍半萜的2位和11位形成含氮吡咯环，氮上通常连有甲基等官能团。其结构特点是含氮吡咯环与倍半萜部分组成紧密的四环体系[12]。含有石斛碱型生物碱的石斛有：金钗石斛(D. nobile Lindl.)、棒节石斛(D.findleyanum Par. et Rchb. f.)、铬黄石斛(D.friedericksianum Lindl)、矩唇石斛(D.Rchb. f.)、D. hildebrandii Rolfe、线叶石斛(D. aurantiacum Rchb. f.)、“红星”春石斛(D. snowflake ‘Red Star)、细茎石斛(D. moniliforme (L.) Sw)、大苞鞘石斛(D. wardianum Warner)。具体化合物结构及所属见表1、图2。

表1 石斛属中石斛碱型生物碱Table 1 Dendrobine-type alkaloids in plants from Dendrobium Sw

图2 石斛碱型生物碱结构Fig. 2 Structures of dendrobine-type alkaloids

其中金钗石斛含有的石斛碱型生物碱最多，有15个(表1)。石斛碱型生物碱的代表性成分石斛碱也是金钗石斛的指标性成分，《中国药典》规定其含量不得少于0.4%。

1.2 药理活性

石斛碱型生物碱主要存在金钗石斛中，而金钗石斛中的石斛碱型生物碱含量远高于其他石斛属植物。所以对于这类化合物的药理作用研究大多集中在金钗石斛生物碱(DNLA)上。

1.2.1 抗肿瘤活性

大量的药理实验结果表明，植物来源的生物碱对肿瘤细胞都具有一定的抑制作用。Lee[33]报道金钗石斛乙醇提取物对肿瘤细胞株A-549、SK-OV-3和HL-60有显著的细胞毒性作用。王亚芸[34]发现金钗石斛水溶性和脂溶性的生物碱对肠癌Cao-2细胞的增殖有明显的抑制作用。安欣[35]研究发现DNLA能通过抑制分裂诱导乳腺癌肿瘤细胞凋亡。何沁嶷[36]通过CCK-8法检测出金钗石斛生物碱对A549、Hepg2、Mnk45细胞体外的增殖有抑制作用。研究发现DNLA能够显著降低人结肠癌HT-29细胞的存活率。Song[37]发现石斛碱(图2(1))与顺铂联合运用，可通过刺激JNK/p38信号通路去增强对A549细胞的细胞毒性，并因此激活促凋亡蛋白Bax和Bimde 表达使A549细胞发生凋亡。此外，还发现石斛碱可减轻顺铂在裸鼠体内引起的体重减轻和心脏毒性。这些结果暗示石斛碱和顺铂的结合可用于非小细胞肺癌的治疗，且具有减轻顺铂心脏毒性的优点。Morita[38]从“红星”春石斛中得到的春石斛碱 A(图2(24))、春石斛碱 B(图2(25))、春石斛碱 C(图2(26))在体外对小鼠白细胞L1210具有细胞毒性。从棒节石斛中分离得到的棒节碱E(图2(29))和棒节碱F(图2(28))对5株肿瘤细胞(HL-60， SMMC-7721， A-549， MCF-7)的生长具有抑制作用[38]。这些结果表明石斛碱型生物碱有成为新的抗肿瘤药物或者前体的潜质。

1.2.2 抗白内障活性

白内障在致盲眼病中位于第一名，糖尿病导致的糖性白内障患者最多。龙艳[40]用金钗石斛生物碱和多糖分别处理大鼠离体晶状体，发现生物碱和多糖都能延缓H2O2造成的晶状体浑浊；再用两者灌胃处理D-半乳糖制备的糖性白内障大鼠模型，发现金钗石斛生物碱能明显减轻大鼠晶状体的混浊度，说明金钗石斛中抗白内障活性的主要成分是生物碱。白金丽等[39]的研究结果表明金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有抗白内障的效果，且总生物碱的效果优于粗多糖。其作用机理可能是通过显著提高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及SOD活性，降低MDA活性等[40]。

1.2.3 降血糖活性

蔡春荣[41]通过饮食和药物诱导的方法建立了糖尿病大鼠模型，结果表明DNLA可以有效促进大鼠胰岛素的分泌，直接保护胰岛β细胞，从而达到降血糖的作用。黄琦[42]研究发现DNLA通过减轻糖尿病大鼠胰岛素抵抗、上调骨骼肌组织GLUT4表达而发挥其降血糖作用。李菲[43]用肾上腺素腹腔注射引起小鼠产生高血糖，再用金钗石斛生物碱灌胃高血糖的小鼠和普通小鼠，发现DNLA只作用于高血糖小鼠的血糖，对普通小鼠无显著影响。除了药物治疗外，有研究[44]表明日常的体力活动：通勤距离、公共交通站点距居住地(工作地)的距离、最近体力活动场所距居住地(工作地)的距离等建成环境变量与成年上班群体身体质量指数(BMI)之间存在显著联系。

1.2.4 其他活性

郭涛[45]用不同浓度的石斛碱处理HuT-78细胞，结果当浓度高于5 μg/mL时，具有明显的细胞毒性，且具有浓度依赖的抑制HuT-78细胞的克隆，意味着石斛碱具有成为治疗急性T淋巴细胞白血病药物的潜力。糖尿病是妊娠期的常见病，以20 mg/kg石斛碱口服给药妊娠糖尿病(GDM)模型的小鼠，发现小鼠的体重和血糖水平都有所下降，以及增加了小鼠的胰岛素水平和胰岛素敏感性，说明石斛碱可明显改善GDM的症状[46]。有学者[47]发现石斛碱还可以通过抑制甲型流感病毒复制周期的早期步骤，从而达到治疗流感病毒感染。还有研究表明[48]石斛碱通过抑制p-NF-κB p65的表达，抑制心脏成纤维细胞增殖和炎症因子表达。

2 石斛碱合成生物学

2.1 石斛碱合成生物学研究进展

石斛碱(dendrobine)是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱，分子式C16H25NO2，分子量263.27，其骨架属于萜类化合物中的倍半萜，由异戊二烯单位组成，具有复杂的环状体系，因此石斛碱在合成上存在一定难度。至今，石斛碱的化学合成有7种全合成和5种表全合成被报道[49]，得率不高，且副产物多、条件复杂。Kaneko[50]合成了石斛碱的三环骨架结构(图3)。Yamada[51]报道了完整的石斛碱的合成途径。2000年，才正式通过人工途径合成石斛碱，得率只有1.2%[52]。

图3 Kaneko合成的三环骨架Fig. 3 Kaneko’s synthesized tricyclic skeleton

石斛碱的生物合成的相关报道较少。1966年，Yamazaki[53]通过放射性同位素示踪技术发现大量的甲羟戊酸-2-14C参与石斛碱的生物合成，提出了石斛碱的生物合成与倍半萜类化合物合成相似，需要甲羟戊酸(MVA)的参与。甲羟戊酸由位于细胞质的MVA途径合成，途径以乙酰辅酶A为原料，在乙酰乙酰辅酶A转移酶(AACT)的催化下将两分子的乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A，随后在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)的催化下生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)，在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的催化下HMG-CoA还原生成甲羟戊酸(MVA)。甲羟戊酸在甲羟戊酸激酶(MK)和磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的连续作用下生成焦磷酸甲羟戊酸。最后在焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)作用下将焦磷酸甲羟戊酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP可在异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)作用下发生可逆反应生成它的同分异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP还可以由位于质体的MEP途径产生(图4)。

图4 植物萜类的生物合成途径Fig. 4 Biosynthesis pathway of terpenoids in plants

从乙酰辅酶A到IPP和DMAPP仅完成了萜类生物合成的三分之一，下一步是合成类萜前体，即香叶基焦磷酸(GPP，C10)、法尼基焦磷酸(FPP，C15)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP，C20)。类萜前体再进一步生成单萜、倍半萜、二萜等萜类化合物。而石斛碱则是在FPP经过萜类合酶、细胞色素氧化酶、环化酶等酶的作用下，合成倍半萜骨架，再经过氨基转移酶、甲基转移酶等后修饰酶的催化下最终生成石斛碱[54](图5)。

到目前为止，由于石斛碱的结构复杂，金钗石斛基因组庞大，能作为可能中间体的次生代谢产物含量低、不易分离，导致石斛碱的生物合成还都停留在推测层面，涉及关键基因和关键酶的报道很少。朱胜男[55]通过构建金钗石斛cDNA文库筛选了参与石斛碱合成的两个托品酮还原酶基因DnTRⅠ和DnTRⅡ，并采用荧光定量PCR技术结合茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、一氧化氮供体(SNP)3种信号分子处理金钗石斛组培苗，分析基因的表达量与组培苗中石斛碱的增量，发现DnTRⅠ和DnTRⅡ基因表达量的增加能促进石斛碱的合成和积累。李清[54]对石斛碱的生物合成做了推测。李金玲[56]从金钗石斛转录组中筛选出了5个参与石斛碱生物合成途径的基因，分别是甲羟戊酸激酶(Unigene1219)、赖氨酸甲基化酶(CL429)、异戊烯焦磷酸异构酶(CL3435)、法尼基转移酶(CL11407)以及半胱氨酸甲基酯酶(CL8067)基因。总之，石斛碱生物合成的下游通路基因功能还有待开发。

图5 石斛碱的生物合成通路的推测(a-q为金钗石斛的次生代谢产物，A-E为可能中间体的骨架)Fig. 5 Speculation on biosynthetic pathway of dendrobine (a-q is secondary metabolites of Dendrobium nobile， A-E is the skeleton of possible intermediates))

2.2 石斛碱代谢途径推测

根据倍半萜的合成途径以及前人的推测，结合目前在金钗石斛中提取的单体化合物，对石斛碱的生物合成过程进行初步推测(见图5)。图5中a-q是从金钗石斛中分离得到的可能中间体，A-E为推测的中间体。a-q依次是a：dendronobilin G[57]、b：dendro- nobilin M[58]、c：dendronobilin A[57]、d：(+)-(1R，5R，6S，8R，9R)-8，12-dihydroxy-copacamphan-3-en-2-one[59]、e：dendronobiloside A[57]、f：dendronobiloside B[57]、g：(-)-(1S，2R，3S，4R，5S，6R，9S，12R)-3，11，13-trihydroxypicrotoxane-2(15)-lactone[61]、h：dendronobilin K[58]、i：(+)-(1R，2S，3R，4S，5R，6S，9R)-2，11，12-trihydroxypicrotoxane-3(15)-lactone[59]、j：dendronobilin B[60]、k：dendronobilin F[60]、l：nobilomethylene[60]、m：dendronobilin D[60]、n：dendronobilin E[58]、o：dendronobilin L[58]、p：dendronobilin C[60]、q：石斛酮碱[18]。

图5中的具体结构变化为由乙酰辅酶A通过MVA途径得到IPP和异构体DAMPP，两者在FPPs的作用下生成FPP，FPP在萜类合酶的催化下，分子内环化形成a，a氧化还原形成A，分子内发生重排并成环形成B，B氧化形成b、c、d这类构型的中间体进一步氧化形成C，C开环水解氧化形成D(中间体e、f的存在证明了D可能是存在的)，D经过分子内酯化形成picrotoxane型倍半萜骨架，含有内酯环且结构符合picrotoxane型倍半萜的中间体有g-o，这类中间体下一步有两种可能：可能成环形成p，再经过氨基化形成D，D甲基化生成石斛碱；直接氨基化形成q，q环化脱羟基生成石斛碱。在这条推测的通路中，关键步骤是FPP到a或者A的环化、A到B中间的分子内重排的变化，关键酶是环化酶、细胞色素氧化酶、甲基转移酶、转氨酶。

3 展 望

石斛碱型生物碱作为我国传统中药石斛所特有的次生代谢产物和活性成分，应用前景广阔。目前，只报道了31个该类化合物，而我国石斛有接近80个种，随着提取分离技术的进步，会有更多的该类化合物被发现。当下石斛碱型生物碱的药理活性研究主要集中在总碱和石斛碱，原因之一就是其他生物碱在通过传统提取分离方法得到的量十分少，远小于石斛碱，不足以支持做更多的活性研究。如果能通过生物合成得到石斛碱，再经过后修饰得到其他的石斛碱型生物碱，这无疑是为生物碱类药物增加一大笔财富。现在的难点在于石斛碱的生物合成还停留在起步阶段，中间的关键酶和关键基因还未有突破，可能的中间体难以分离。

其次，综合目前的药理研究，可以看出石斛碱在抗肿瘤方面具有显著的活性，尤其是石斛碱在抗非小细胞肺癌上的作用，暗示石斛碱有可能成为新的抗癌药物。但是目前石斛碱的获得主要依赖于从金钗石斛原料中提取，得率有限且副产物多，而且金钗石斛属于国家濒危药用植物，野生资源岌岌可危，栽培品种质量参差不齐。综上所述，石斛碱生物合成将成为今后研究的重点与热点之一，其生物合成途径中的各种未知，还需更加系统的研究。

目前，可能通过以下途径来将石斛碱的生物合成向前推进：从金钗石斛的基因组入手，找到参与倍半萜合成的环化酶基因，再以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，通过酶促反应，得到FPP环化后的产物，这个产物有可能成为石斛碱生物合成的中间体；从金钗石斛组培苗入手，将FPP加入培养基中，诱导培养的同时检测倍半萜类成分的含量变化，以期从中找到可能中间体；根据石斛碱在金钗石斛中的积累特征，从石斛碱含量最低到石斛碱含量最高的过程中找到一个关键点，有可能是中间体累积最多的点，再通过各种检测技术来解析出这个点可能产生的中间体化合物。

通过这几个方面的共同努力，还是可能将石斛碱生物合成的研究成功推进一步。