吩嗪类衍生物的抗真菌活性研究

邱丽娟，巣 雯，石安喆，阎 澜，吕权真，姜远英 （海军军医大学：. 基础医学院, . 药学院，上海 200433）

近年来，随着免疫抑制剂的广泛使用和介入手术的增多，深部真菌感染的发病率逐年上升。同时，手术患者的增加，住院天数的增长，也使得院内真菌感染成为急需解决的问题。在治疗真菌感染过程中长周期的给药方式和真菌耐药问题造成了政府和住院患者的医疗支出大幅增加，新的抗真菌药物或者协同抗真菌药物研究迫在眉睫。为了克服真菌的耐药性问题，本课题组一直致力于研究药物联用协同抗耐药真菌的效果。据统计，真菌感染中最常见菌属是念珠菌，而在念珠菌中白念珠菌的占比又高达45%～50%，因此，靶向于白念珠菌的药物研究就显得十分重要[1-6]。2010 年，Morales 等报道了化合物吩嗪硫酸甲酯具有抗白念珠菌被膜的活性[7]。为了进一步获得具有更强抗真菌活性的先导化合物，我们筛选了以吩嗪为骨架的20 余种吩嗪类衍生物，获得了具有协同氟康唑抗真菌活性的化合物吩嗪衍生物-17，本研究为抗耐药真菌联合用药提供了新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

洁净工作台（HPeafe-1200LC(A2)上海力申科学仪器有限公司）；振荡培养箱（HZ-2111K-B 江苏太仓市实验设备厂）；微量加样器（Biohit）；小型冷冻离心机（HitachiCT15RE）；蒸汽灭菌锅（KGSX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO，Japan）；多功能酶标仪（TECAN Infinite M200）；倒置相差显微镜（Amersham Pharmacia AMG EVOS×1）；紫外分光光度计（Amersham Biosciences Mltrospec10）。

1.2 材料

白念珠菌标准菌株SC5314 由美国Georgetown大学William A Fonzi 教授赠送，临床分离的耐药白念珠菌103 和538 来自海军军医大学附属长海医院皮肤科，氟康唑（FCZ）由辉瑞公司生产，吩嗪类化合物购自chemdiv 化合物库，二甲基亚砜（DMSO）购自博光生物试剂有限公司，酵母提取物、甘露醇、营养肉汤购自BD 公司，蛋白胨、葡萄糖、琼脂均购自上海生工生物技术有限公司，RPMI1640 购自Gibco 公司。

2 实验方法

2.1 吩嗪类衍生物体外抗真菌活性与抗菌谱测定

将保存在SDA 固体培养皿的SC5314 单克隆菌株转接到1 ml YEPD 培养基，30 ℃、200 r/min，培养过夜，使真菌菌株处于指数生长平台期。①洗菌：将活化好的菌株转移到1.5 ml 离心管中，用无菌PBS 缓冲液洗3 次，再用1 ml PBS 重悬。②调节浓度：用RPMI1640 稀释菌液100 倍，使其浓度为（1～5）×106CFU/ml。再用RPMI1640 稀释1 000倍，使菌终浓度（1～5）×103CFU/ml。③制备药敏实验板：取一块96 孔板，第1 列加入100 μl RPMI 1640 液体培养基做空白对照；第2 列加200 μl 上述菌液，第3～12 列分别加入100 μl 上述菌液，第2 列加吩嗪类衍生物使其终浓度为64 μg/ml，2～11 列进行倍比稀释，使得药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每个药都加2 个复孔（2 行），以减少实验误差，铺好药和菌的96 孔板用封条封闭，于30 ℃恒温培养过夜，用酶标仪在λ=630 nm 测吸光度（A）值，计算MIC80值。

2.2 吩嗪类衍生物协同氟康唑的体外抗真菌活性和抗菌谱的研究

菌株活化、洗菌和调菌浓度同前所述，取一块96 孔板，第1 列加入100 μl RPMI1640/YEPD 培养基做空白对照；第12 列加入100 μl 上述菌液做阳性对照；剩余菌液加入适量氟康唑，使得氟康唑终浓度为2 μg/ml，第2 列加入该配制好的菌液200 μl，第3～11 列加入该配制好的菌液100 μl，第2 列再加入吩嗪类衍生物使其终浓度为64 μg/ml，2～11 列进行倍比稀释，使得药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，每种药都加2 个复孔（2 行），以减少实验误差，将铺好药和菌的96 孔板用封条封闭，于30 ℃恒温培养过夜，用酶标仪在λ=630 nm 处测A值，计算最低抑菌浓度（MIC80）和协同指数（FICI）。

除了用上述耐药白念珠菌103 实验外，再更换菌株为538，重复上述实验步骤进行实验。

2.3 吩嗪衍生物-17 与氟康唑合用对白念珠菌菌丝形成能力的影响

过夜活化的白念珠菌SC5314 分别用Spider培养液和RPMI1640 培养液稀释1 000 倍，分别加药使吩嗪衍生物-17 终浓度为4 μg/ml、FCZ 的终浓度为4 μg/ml 以及吩嗪衍生物-17 与FCZ 的合用（浓度与单药相同），空白对照加入同体积的DMSO，充分混匀，转移至12 孔板中，37 ℃，静置培养3 h，倒置显微镜观察菌丝形态。

3 结果与讨论

3.1 吩嗪类化合物体外抗真菌活性与抗菌谱的测定

通过对吩嗪类24 种衍生物的体外抗真菌活性研究发现，吩嗪类化合物单用对白念珠菌没有抗真菌活性，其MIC80均＞128 μg/ml。在RPMI1640 培养液中，采用临床分离的氟康唑耐药白念珠菌103 和538（氟康唑单用时，MIC80＞32 μg/ml），考察吩嗪类化合物协同氟康唑的抗真菌活性。结果显示，当吩嗪类化合物与2 μg/ml 的氟康唑合用时，0.25～0.5 μg/ml 的吩嗪衍生物-12、0.125 μg/ml 的吩嗪衍生物-17、1～2 μg/ml 的吩嗪衍生物-18 协同氟康唑后有明显的抗耐药白念珠菌的活性，结果见表1。而后我们采用棋盘式微量液基稀释法，进一步考察了氟康唑和吩嗪衍生物-12、吩嗪衍生物-17、吩嗪衍生物-18 合用时的最低浓度，结果显示吩嗪衍生物-17 与氟康唑协同抗白念珠菌菌效果最强，0.062 5 μg/ml 的吩嗪衍生物-17 与1 μg/ml 的氟康唑即可完全抑制耐药白念珠菌的生长，协同指数FICI＜0.5，说明与氟康唑具有明显的协同作用（表2）。

表1 吩嗪类衍生物（2 μg/ml）协同氟康唑对氟康唑耐药白念珠菌103MIC80 值的测定结果

(续表1)

(续表1)

表2 吩嗪类衍生物与氟康唑单用及合用对氟康唑耐药白念珠菌538 的MIC80 值和FICI 值的测定结果

3.2 吩嗪类衍生物-17 与氟康唑合用抑制白念珠菌菌丝形成

为了进一步考察吩嗪类衍生物-17 的体外抗菌活性，我们考察了其对菌丝生长的抑制作用。结果表明，在RPMI1640 诱导菌丝形成的过程中，吩嗪衍生物-17 与氟康唑合用对菌丝的生长抑制不明显，但在Spider 培养基中，两药合用对菌丝的形成有明显抑制作用（图1）。

图1 吩嗪类衍生物-17 抑制白念珠菌的菌丝形成

4 讨论

近年来，随着免疫抑制剂的广泛用、手术介入和免疫缺陷患者的增多，系统性真菌感染的发病率逐年攀升。但抗真菌药物的研发进展缓慢，现有的几类抗真菌药物在长期使用后也逐渐出现了耐药性。为克服临床真菌感染的问题，研发新的抗真菌药物意义重大。本课题组长期致力于协同抗耐药真菌研究，期望筛选获得具有协同抗耐药真菌活性的化合物，进而达到降低给药剂量，提高抗菌能力的目的，为临床抗真菌治疗提供新的策略。本研究前期通过体外筛选吩嗪类化合物的抗真菌活性，发现吩嗪类化合物单药使用时没有抗真菌活性，但是吩嗪衍生物-12、-17、-18 与氟康唑合用有显著的协同抗真菌活性，这一研究结果有望为抗真菌药物研发提供新的思路。该研究尚未探讨吩嗪类衍生物的协同抗耐药真菌机制，后续仍需进一步深入研究。