重症颅脑损伤患者血清微小RNA-126、血管细胞黏附分子-1与迟发性颅内血肿的关系

王 霞 刘 琴 周泽华 刘国平 孟光荣 孟小鹏

颅脑损伤(Craniocerebral Injury，CI)是神经外科常见的一种创伤性疾病，重症CI患者易发生迟发性颅内血肿(Delayed Traumatic Intracranial Hematoma，DTIH)，对重症CI患者的生命安全及生存质量构成极度威胁[1]。目前CI并发DTIH发生机制尚无定论，因此，寻找CI并发DTIH的相关因素，对CI并发DTIH具有一定临床指导意义。有研究发现CI发生后，患者外周血中微小RNA(MicroRNA，miRNA)存在异常表达，且CI患者脑组织常伴有缺血缺氧或脑血管自身调节功能障碍，易引发DTIH[2,3]。微小RNA-126(MicroRNA-126，miR-126)在脊髓损伤后表达下调，可影响血管生成和炎症反应过程，进而在脊髓损伤中发挥重要作用[4]。血管细胞黏附分子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1,VCAM-1)与脑损伤继发性脑损害的炎症反应有关，其在重度CI患者呈高表达，经重组人促红细胞生成素治疗后，VCAM-1表达水平降低，VCAM-1有望成为重度CI患者康复指标[5]。但miR-126和VCAM-1在重症CI并发DTIH患者血清中的表达情况鲜有报道。基于此，本研究初步探究miR-126、VCAM-1在CI患者、CI并发DTIH患者血清中的表达水平，分析两者与CI患者并发DTIH的关系，以期为临床早期防治CI并发DTIH提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

选择2015-03-2019-02本院收诊的重症CI患者289例，所有患者诊断均符合《现代颅脑损伤学》重症CI的相关标准[7]。参考文献[8]进行DTIH判定。依据是否发生DTIH，将患者分为DTIH组(102例)和非DTIH组(187例)；DTIH组中男62例，女40例；年龄31-62岁，平均年龄(46.64±10.81)岁。非DTIH组中男95例，女92例；年龄30-61岁，平均年龄(45.96±10.72)岁。选取本院同时间段内135例体检健康者为对照组，其中男69例，女66例；年龄30-63岁，平均年龄(46.25±10.77)岁。三组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例纳入和排除标准

纳入标准：(1)经头颅螺旋CT确诊为重症CI者或重症CI并发DTIH；(2)所有患者入院进行格拉斯哥昏迷评分(Glasgow Coma Scale，GCS)，GCS范围为3-8分；(3)患者受伤至入院时间<24h；(4)所有受试者家属自愿参与该项研究，且中途未退出。排除标准：(1)合并严重四肢、胸、腹损伤者；(2)合并近期手术、急/慢性感染、凝血功能障碍或免疫系统疾病者；(3)合并脏器功能衰竭、恶性肿瘤者；(4)近期接受心肺复苏、抗凝治疗者。

所有受试者家属签署知情同意书，且本研究获得本院伦理委员会批准，研究所用方法符合《赫尔辛基宣言》。

1.3 主要试剂与方法

TRIzol试剂(货号：GMS12279)购买于上海杰美基因医药科技有限公司，Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(货号：04655877001)购买于上海易汇生物科技有限公司，TaqMan Human MicroRNA Assay(货号：4398965)购买于上海恪敏生物科技有限公司，Taqman Universal master mix(货号：4347166)购买于上海宾智生物科技有限公司。引物购买于上海基康生物技术有限公司，各引物序列见表1。紫外分光光度计(型号：DU-800)购买于上海智岩科学仪器有限公司，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：SimpliAmp)购买于赛默飞世尔科技。

表1 引物序列

1.4 观察指标和方法

1.4.1一般临床资料收集：收集患者性别、年龄，入院时收缩压、舒张压、血浆凝血酶原时间、GCS评分等临床基本资料。

1.4.2qRT-PCR法检测血清中miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平：收集所有研究对象入院空腹外周血6-7ml，室温自然凝集30min，4℃、3 500g/min离心12min，收集上层血清，分装于无RNA酶冻存管中，保存于-80℃冰箱中，待样本集齐后集中检测。检测前取出冻存于-80℃冰箱中的血清样本，冰上解冻，无菌环境下，根据TRIzol试剂说明书抽提所有血清样本总RNA，测定RNA纯度及浓度，并验证RNA完整性。参照逆转录试剂盒说明书，应用Transcriptor One-Step RT-PCR Kit合成cDNA。按照TaqMan Human MicroRNA Assay、Taqman Universal master mix说明书流程将所得cDNA进行扩增、PCR检测血清miR-126、VCAM-1、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)相对表达水平。miR-126以U6为内参，VCAM-1、VEGF、TNF-α以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α相对表达量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组基本临床指标比较

对照组、非DTIH组和DTIH组三组间收缩压、舒张压差异无统计学差异(P>0.05)，血浆凝血酶原时间差异有统计学意义(P<0.05)；与非DTIH组相比，DTIH组患者血浆凝血酶原时间明显延长(P<0.01)，GCS评分明显升高(P<0.01)。详见表2。

表2 各组基本资料比较

2.2 各组血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平比较

各组血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平差异有统计学意义(P均<0.01)。与对照组相比，非DTIH组、DTIH组血清miR-126表达水平明显降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平均明显升高(t均>4.793，P均<0.01)；与非DTIH组相比，DTIH组血清miR-126表达水平明显降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平均明显升高(t均>11.528，P均<0.01)。详见表3。

表3 各组血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表达水平比较

2.3 重症CI并发DTIH患者血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α水平的相关性

Pearson法分析显示，重症CI并发DTIH患者血清miR-126表达水平与VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈负相关(r=-0.489、-0.375、-0.575，P均<0.01)，VCAM-1与VEGF、TNF-α均呈正相关(r=0.360、0.418，P均<0.01)。

2.4 Logistic回归分析重症CI并发DTIH的影响因素

以重症CI并发DTIH为因变量，以血浆凝血酶原时间、GCS评分、miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示血浆凝血酶原时间、VCAM-1、VEGF、TNF-α为重症CI并发DTIH的独立危险因素(P<0.01)，miR-126为重症CI并发DTIH的独立保护因素(P<0.01)。详见表4。

表4 重症CI并发DTIH的Logistic回归分析

3 讨 论

CI可引发脑组织水肿、脑梗死、DTIH等继发性CI，具有较高致残率和致死率，严重威胁患者生活质量及生命[8]。因此，寻找有效评估CI并发DTIH指标，对CI患者进行实时监控，及时防治DTIH，可有效提高CI患者生存率。

miRNA可在机体代谢、个体发育、信号转导、炎症反应、血管生成等生理病理过程中起重要生物调节作用[9]。miRNA在脑梗死、脑水肿、CI、DTIH等疾病中表达异常，可作为缺血缺氧脑损伤相关疾病的诊治靶标[10]。miR-191在急性缺血脑卒中表达异常，其可通过靶向血管内皮锌指蛋白1抑制血管生成，进而在缺血性脑损伤中发挥重要调节作用，miR-191可作为诊治急性缺血脑卒中的生物靶标[11]。Di等[12]研究显示，miR-425-5p在CI患者中异常表达，其可用于CI病情判断及预后评估。以上研究证实，miRNA表达失调与脑损伤类疾病发生发展密切相关。miR-126与血管生成、血管炎症有关，在脑出血患者血清中呈低水平，且其成员miR-126-3p可缓解脑出血后引起的血脑屏障破坏、神经元损伤及脑水肿，miR-126及miR-126-3p在脑损伤疾病发展过程中起重要作用[13]。miR-126可促进血管重塑，减少纤维化，缺血性脑卒中患者miR-126表达下调，其miR-126与脑卒中发病关系密切[14]。本研究中DTIH组患者血清miR-126表达水平明显低于非DTIH组和对照组，提示低miR-126水平可能参与并影响重症CI并发DTIH的进程。推测miR-126表达下降可能会加重患者血管纤维化和炎症反应，从而增加重症CI并发DTIH的发病率，影响预后。VCAM-1是血清黏附分子，可介导血管内皮细胞黏附，影响血管壁完整性及组织缺氧引发的炎症反应，VCAM-1在老年急性脑梗死患者中表达失调，与急性脑梗死发病有关[15]。局灶性脑缺血损伤患者VCAM-1表达水平升高，经西洋参茎叶总皂苷治疗后，其表达水平降低，炎症和脑水肿减轻，提示VCAM-1可能在局灶性脑缺血损伤发展过程中发挥重要作用[16]。以上研究表明，VCAM-1可能与缺血性脑病炎症反应过程有关。本研究中DTIH组患者血清VCAM-1水平均明显高于非DTIH组和对照组，提示高表达VCAM-1在重症CI并发DTIH疾病发生发展中起一定作用，推测高表达VCAM-1可能会加剧患者炎症反应，进而影响重症CI并发DTIH的发展。

VEGF是具有促进内皮细胞增殖、增加血管通透性、诱导血管生成等生物学功能的多功能细胞因子，对颅内血管内膜损伤异常敏感，VEGF在发生创伤性脑损伤后异常表达，与脑损伤发展过程密切相关[17]。TNF-α是机体免疫应答及炎症反应的重要调节因子，其在急性CI中表达升高，CI发生后TNF-α可能激活水通道蛋白4，引起严重脑水肿，使脑组织严重缺血缺氧，TNF-α有助于评估CI严重程度[18]。本研究显示，DTIH组患者血清VEGF、TNF-α表达水平明显高于非DTIH组和对照组，提示VEGF、TNF-α可能与重症CI并发DTIH发展过程相关。其原因可能是VEGF具有改变血管通透性、影响内皮细胞增长及血管新生的作用，而TNF-α可调节免疫应答及炎症反应，二者共同影响DTIH的发生和发展。

本研究中重症CI并发DTIH患者血清miR-126表达水平与VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈负相关，VCAM-1与VEGF、TNF-α均呈正相关，提示miR-126、VEGF、TNF-α与VCAM-1相互作用，从而共同影响重症CI并发DTIH进展。进一步研究发现血浆凝血酶原时间、VCAM-1、VEGF、TNF-α是重症CI并发DTIH的独立危险因素，miR-126是重症CI并发DTIH的独立保护因素，提示血浆凝血酶原时间延长，VCAM-1、VEGF、TNF-α水平升高，miR-126水平降低，均可能增加重症CI并发DTIH的几率，实时监测重症CI患者血浆凝血酶原时间、miR-126、VEGF、TNF-α及VCAM-1水平，有助于早期评估重症CI并发DTIH的几率并及时控制疾病发展。

综上所述，重症CI并发DTIH患者血清miR-126低表达，VCAM-1高表达，miR-126、VCAM-1均可能是影响重症CI并发DTIH的影响因素，两者参与并影响重症CI并发DTIH进程。但本研究样本量较少，实验结果可能会出现偏倚，后续将扩大样本量进一步研究。

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