大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

周正炜，郭派派，王曼曼，孙寒飞，王 珍，邰 宇，刘 琪，张巧琳，吴华勋，汪庆童，魏 伟

多种疾病可引起唾液腺功能减退，典型代表为干燥综合征(Sjogren′s syndrome, SS)，目前尚无有效的治疗药物。已有研究表明，唾液腺中的成纤维细胞异常活化，产生大量胶原，引起唾液腺发生纤维化是SS患者唾液腺功能损伤，唾液分泌量减少的重要病理机制。因此对唾液腺成纤维细胞功能异常的发生机制、细胞功能改善方法的研究有助于深入理解SS病理机制和寻找有效的治疗手段。实验动物原代唾液腺成纤维细胞的分离培养将为上述研究提供实验保障。然而目前尚没有成熟的原代唾液腺成纤维细胞的分离培养方法，使相关细胞学研究的开展颇为困难。该课题组通过胰酶消化法成功的从新生大鼠颌下腺中分离得到形态良好、纯度较高的成纤维细胞，并摸索出适合的培养条件，为进一步从细胞分子水平开展SS研究提供实验手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级新生48 h内的SD乳鼠4只，体质量5～6 g，雌雄不限，由安徽医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(皖)2017-001。本实验方案已通过安徽医科大学临床药理研究所动物伦理委员会批准。

1.2 主要实验试剂及仪器

DMEM/F12 1 ∶1培养基、DPBS购自美国HyClone公司；青霉素-链霉素溶液(×100)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、DAPI染色液、抗荧光猝灭封片液购自上海Beyotime公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自以色列Biological Industries公司；明胶购自北京Solarbio公司；兔抗波形蛋白多克隆抗体、鼠抗GAPDH单克隆抗体、CoreLite488标记的羊抗兔二抗购自美国Proteintech公司；羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗购自美国Jackson Immuno Research公司；人下颌下腺细胞(human salivary gland, HSG)购自宁波明舟生物科技有限公司；Anti-Mo/Rt CD90 PE购自美国eBioscience公司。倒置显微镜购自美国GE Healthcare Life Sciences公司；Image Xpress Micro 4 型高内涵细胞成像系统购自美国Molecular Devcies公司；BD FACSAriaTMII Cell Sorter 分选流式购自美国BD公司。

1.3 颌下腺成纤维细胞分离培养方法

1.3.1

培养皿明胶包被

1 g明胶加100 ml双蒸水，高压蒸汽灭菌，在培养皿中加入2 ml稀释为0.1%的明胶溶液，轻轻摇晃，使明胶溶液均匀分布在培养皿底部，将培养皿放置在37 ℃、5%CO培养箱中1 h，取出后弃上清液备用。

1.3.2

取材 将SD乳鼠置于75%酒精缸中浸泡5 min，无菌条件下使用眼科剪取出颈部两侧颌下腺，除去结缔组织及包膜，用预冷的DPBS反复洗涤3～5遍，将组织转移至无菌1.5 ml EP管中，充分剪碎(<1 mm)，再移至15 ml的离心管中。

1.3.3

胰酶消化 在装有组织的15 ml离心管中加入5 ml 0.125%胰酶消化液(0.25%胰酶、DPBS=1 ∶1)吹打30～60 s，置于37 ℃恒温箱中振荡5 min，再反复吹打30～60 s，静置3 min，用无菌吸管吸取上清液，将上清液用100目筛网过滤后加入15 ml离心管，并加入同体积DMEM/F12细胞培养液(含10% FBS，1%青霉素-链霉素溶液)终止消化。未消化的组织再次加入5 ml 0.125%胰酶消化液，吹打30～60 s后再次置于37 ℃恒温箱中振荡5 min，静置吸取上清液，总计消化3次，组织基本消失。

1.3.4

细胞培养和传代 将分次收集的细胞悬液以1 500 r/min，离心5 min，弃上清液，加入5 ml DMEM/F12细胞培养液(含10% FBS，1%青霉素-链霉素溶液)重悬细胞，转移至0.1%明胶包被的培养皿中，于37 ℃、5%CO培养箱中培养，次日换液，此后每2～3 d换液1次；待细胞融合达80%左右，用0.25%胰酶消化传代至无明胶包被的培养瓶中培养。

1.4 颌下腺成纤维细胞形态观察与鉴定

1.4.1

形态学观察

倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1.4.2

免疫荧光法检测细胞波形蛋白表达 取第2代细胞、MH7A、HSG细胞株进行爬片，贴壁24 h后，室温固定、破膜封闭，加入1 ∶200的兔抗波形蛋白多克隆抗体4 ℃孵育过夜；充分洗涤后加入1 ∶200 CoreLite488标记的羊抗兔二抗避光孵育1 h，DAPI染核8 min，防淬灭荧光剂封片后在激光共聚焦显微镜下观察。

1.4.3

Western blot检测细胞中波形蛋白表达水平 用细胞裂解液提取本方法获得的原代颌下腺细胞以及MH7A、HSG细胞的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后用1 ∶4 000的兔抗波形蛋白多克隆抗体或1 ∶20 000鼠抗GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，1 ∶40 000相应二抗37 ℃孵育2 h后加入ECL显影液曝光，采用Image J图像分析软件进行条带灰度值分析。

1.4.4

RT-PCR检测波形蛋白mRNA的表达 使用TRIzol溶液，抽提MH7A细胞、原代颌下腺成纤维细胞和HSG细胞总RNA,反转录获得cDNA，用TB Green Premix Ex TaqⅡ试剂盒对波形蛋白mRNA表达水平进行检测，以GAPDH为内参。引物： vimentin(Rat) 上游：5-AGCGCTCCTACGATTCACAG-3，下游：5-TGTGGACGTGGTCACATAGC-3; vimentin(human)上游：5-TCCGCACATTCGAGCAAAGA-3, 下游：5-TGATTCAAGTCTCAGCGGGC-3；GAPDH(Rat) 上游：5-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3，下游：5-TCTGTGGTGATGTAAATGTCCTCT-3；GAPDH(human) 上游：5-AATGGGCAGC-CGTTAGGAAA-3，下游：5-GCGCCCAATACGAC-CAAATC-3；按照2法计算mRNA表达量。

1.4.5

流式细胞术检测成纤维细胞纯度 收集第3代细胞，PBS洗涤后重悬，孵育CD90表面抗体，分选流式分选出阳性细胞，将分选出的阳性细胞按1 ∶1体积加入破膜剂，兔抗波形蛋白多克隆抗体孵育40 min，CoreLite488标记的羊抗兔二抗避光孵育30 min，同型对照组只孵育二抗，PBS洗涤细胞，200 μl PBS重悬细胞上机检测。

1.5 高内涵检测不同浓度血清以及不同时间对细胞增殖能力的影响

将密度为2×10/ml的第3代颌下腺成纤维细胞，分别重悬于含0%、5%、10%、15%、20% FBS的培养液中，接种于96孔板，每孔100 μl，培养12、24、48 h，弃培养液，室温固定，DAPI染核8 min，充分洗涤后每孔加入100 μl PBS，高内涵细胞成像系统拍摄并计算每孔细胞总量，实验重复3次。

1.6 统计学处理

采用GrapdhPad Prism 6.01软件进行统计学分析，多组间差异的比较采用单因素方差分析，以

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养的大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞形态学观察

刚消化分离获得的细胞呈亮球形，轮廓清晰，单个散在分布或聚集成细胞团(图1A)；皿中培养90 min后即有大量细胞贴壁，其中部分已开始伸展(图1B)；24 h后大多数贴壁细胞已伸展成短梭形，并且散在生长(图1C)；3～4 d时细胞呈细长梭形或多角形，胞核清晰，一般不形成集落(图1D)；5～6 d时可发生融合，漩涡状或纵横状排列，贴壁的细胞团呈放射状生长，待细胞融合达到80%左右时进行传代培养(图1E)；传代后细胞贴壁及伸展速度更快，多数细胞在消化处理后60 min开始伸展。1～2 d即可发生融合生长(图1F)。随传代次数的增加，至第五代以后，细胞生长开始变慢，并出现一些体积较大，扁平伸展的纺锤形细胞或星形细胞，逐渐失去梭形形态(图1G)。提示消化培养2～5代的颌下腺成纤维细胞适用于开展体外实验。

图1 组织分离培养的颌下腺成纤维细胞形态学观察 ×50

图2 新生大鼠颌下腺成纤维细胞波形蛋白表达情况

2.2 原代培养的大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞鉴定

2.2.1

SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞波形蛋白表达和分布情况 免疫荧光法检测发现，体外培养的第2代新生SD大鼠颌下腺成纤维细胞波形蛋白表达呈强阳性，主要分布于细胞质中。HSG细胞株为人下颌下腺上皮样细胞，有较弱的波形蛋白染色，与颌下腺成纤维细胞相比差异较大(

P

<0.001)，MH7A细胞株为滑膜成纤维细胞，有较强的波形蛋白染色，与颌下腺成纤维细胞相比差异较小(

P

<0.05,

F

=628.7)(图2)，提示从新生SD大鼠颌下腺分离培养得到的细胞符合成纤维样细胞的特征。

2.2.2

SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞波形蛋白表达水平 提取原代大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞、MH7A细胞和HSG细胞蛋白，Western blot法检测细胞中波形蛋白的表达水平。结果显示，分离培养得到的颌下腺成纤维细胞波形蛋白(相对分子量为54 ku)表达水平较高；作为对照，MH7A细胞波形蛋白表达较强，人HSG细胞波形蛋白表达微弱，与MH7A细胞相比，波形蛋白的表达水平差异无统计学意义，与HSG细胞相比，波形蛋白的表达水平差异有统计学意义(

P

<0.01，

F

=22.06)(图3)。

2.2.3

SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞波形蛋白mRNA表达水平 抽提MH7A细胞、原代颌下腺成纤维细胞和HSG细胞总RNA，RT-PCR检测波形蛋白mRNA的表达水平。结果显示，分离培养得到的颌下腺成纤维细胞波形蛋白mRNA表达水平较高；作为对照，MH7A细胞波形蛋白mRNA表达水平较强，人HSG细胞波形蛋白mRNA表达水平较弱。原代颌下腺成纤维细胞与MH7A细胞的波形蛋白mRNA水平差异无统计学意义，HSG细胞与颌下腺成纤维细胞相比，波形蛋白的mRNA表达水平差异有统计学意义(

P

<0.001，

F

=64.65)(图4)。

图3 MH7A细胞、原代大鼠乳鼠颌下腺 成纤维细胞和HSG细胞中波形蛋白的表达水平

图4 MH7A细胞、原代大鼠乳鼠颌下腺 成纤维细胞和HSG细胞中相对波形蛋白mRNA的表达水平

2.2.4

原代培养的大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞纯度检测 大鼠乳鼠颌下腺组织经消化获得的细胞进行传代培养，取传代培养第3代的细胞制备单细胞悬液，经分选流式分选后，固定破膜，经间标法标记细胞中的波形蛋白，并设立仅二抗染色的同型对照。流式细胞术检测结果显示，经传代培养3次，组织细胞培养体系中波形蛋白阳性的细胞约为87%，提示经酶消化法获得的大鼠乳鼠颌下腺组织细胞中，经分选流式分选后成纤维细胞含量较高，可满足以其为对象的体外研究需要。(图5)。

2.2.5

不同培养条件对原代培养的大鼠颌下腺成纤维细胞生长的影响 为探索原代培养成纤维细胞较合适的培养条件，96孔板每孔加入相同数量的原代大鼠颌下腺成纤维细胞，给予含0%、5%、10%、15%、20%FBS的DMEM/F12培养基分别培养12、24、48 h，培养结束固定细胞，DAPI染色，高内涵细胞成像系统计算细胞数量。结果表明，大鼠颌下腺成纤维细胞在含5%、10%FBS的培养基中生长状态良好；与0% FBS培养基组比较，其他各组不同血清含量培养的细胞，在24 h均增殖明显(

P

<0.001)，48 h的培养不能进一步提高细胞数量；在培养24和48 h时，与含5% FBS培养基组比较，10%、15%、20%FBS细胞数量相对减少(

P

<0.01，

F

=14.34)(图6)，提示含5%FBS的DMEM/F12培养基适用于细胞的维持培养，细胞在培养24 h后即大量增殖。

3 讨论

唾液腺是一种复杂的分泌组织，可产生唾液并维持口腔稳态。多种因素引发唾液腺疾病,比如自身免疫性疾病、辐射诱发的唾液腺萎缩等。目前对于唾液腺疾病的病理机制尚不十分明确，最主要的研究集中在唾液腺的T、B淋巴细胞以及上皮细胞等。大量文献表明，T、B淋巴细胞、上皮细胞等在唾液腺疾病的发生发展中发挥重要的作用。目前也有研究显示，唾液腺成纤维细胞的异常活化在唾液腺疾病的发展中也发挥重要作用，成纤维细胞异常活化分泌大量的纤维蛋白，导致腺体功能减退，唾液分泌减少，但对于唾液腺中成纤维细胞异常活化的机制研究相对较少，课题组前期查询到有小鼠颌下腺成纤维细胞的细胞株，但目前并没有较好的方法分离提取原代颌下腺成纤维细胞，使得在体外开展相关唾液腺成纤维细胞的机制研究难度较大，尤其是在使用敲基因小鼠研究唾液腺疾病的发生机制时体外实验进展颇为困难。故建立一种稳定、有效的体外原代颌下腺成纤维细胞培养方法对唾液腺疾病的研究、防治有着深远意义。

图5 原代培养的大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞纯度检测

图6 不同浓度FBS对原代培养的大鼠 乳鼠颌下腺成纤维细胞生长的影响

课题组前期查询到乳鼠的其他部位如乳腺等腺体的原代成纤维细胞提取的相关文献或者心脏、肺等组织的原代成纤维细胞的实验研究, 并未查到关于原代颌下腺成纤维细胞培养的文献报道。本实验前期利用组织块贴壁法，发现腺体黏液较多，组织块并不能很好的贴壁吸附，提取出来的细胞较少；在探索实验方法中发现胰酶消化后培养，能使细胞与培养液充分接触，并且能够清楚地观察到细胞的状态，但是胰蛋白酶对细胞膜有较大损伤，浓度过高或者消化时间过长，都有可能损伤细胞，使得细胞丧失贴壁能力。最终采用0.125%胰蛋白酶多次消化颌下腺，收集消化后的单细胞悬液。由于颌下腺腺体是混合型腺体，提取出来的细胞混杂有上皮细胞等其他贴壁细胞。成纤维细胞增殖能力较强，生长较快，本课题组对提取的细胞在第3代进行了纯度鉴定。CD90是成纤维细胞的特异性标志物，经流式检测CD90阳性细胞占比约87%，经分选流式分选出CD90阳性细胞，再经间标法标记波形蛋白，纯度约达99%，基本达到体外实验需求。

本实验采用胰酶消化法分离提取的原代颌下腺成纤维细胞，通过镜下观察细胞形态：呈细长梭形或多角形、漩涡状或纵横状排列，符合成纤维细胞的表征，与MH7A细胞形态相似，区别于HSG细胞株形态。Western blot法验证波形蛋白表达, 为单一清晰条带。波形蛋白染色呈阳性鉴定细胞为成纤维细胞，并且与HSG细胞相比有较大差别。分离培养的第3代细胞经分选流式分选后，流式鉴定纯度达87%，可满足以其为对象的体外研究需要。高内涵检测颌下腺成纤维细胞生长能力表明，含5% FBS的DMEM/F12培养基可用于细胞的维持培养。第5代及第5代之后细胞出现生长速度慢, 死细胞数量稍有增多, 出现一些体积较大、扁平伸展的纺锤形细胞或星形细胞。分析原因可能是传代次数多、细胞活力下降、细胞老化、分裂增殖缓慢等情况，提示提取分离的原代大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞2～4代可用于开展体外实验研究。

综上所述, 本研究基本确立了大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的原代培养方法，细胞具有较稳定的生物学特性和较高的纯度，并筛选出较合适的培养条件。为唾液腺成纤维细胞的体外功能研究提供了细胞获得方法及良好的实验基础。