miR-485-5p介导SOX5基因表达对肝细胞肝癌细胞活力及迁移侵袭的影响

韩成美，柳 梅，任维鑫，朱英斌，陈茂丽

微小RNA(microRNA, miRNA)被报道通过调控其靶基因的表达在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。miR-485-5p在肿瘤中被发现表达异常，在胶质瘤和非小细胞肺癌等恶性肿瘤中表达减少，可抑制肿瘤的恶性进展。miR-485-5p抑制肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的增殖和迁移侵袭能力。性别决定区Y框蛋白5(sex determinant Y box protein 5, SOX5)在HCC中促进细胞的迁移和侵袭能力，SOX5在HCC中是否发挥其它的生物学作用，以及SOX5是否作为miR-485-5p的靶基因参与HCC的发生发展引起课题组的关注，该文对此及其可能的作用机制进行了研究，旨在获得miR-485-5p作为HCC治疗潜在靶点的重要实验室依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集

收集2018年6月—2019年10月入住山东第一医科大学附属济南人民医院行手术治疗的HCC患者的癌组织和癌旁组织，癌旁组织为距离肿瘤组织边缘3 cm以上的非癌肝组织，癌组织和癌旁组织均经病理专家确认。要求收集临床样本为首次行手术切除的病灶，并在术前未经放化疗等任何形式的治疗。将切除的PTC及癌旁组织立即冻存于-80 ℃液氮中。所有患者签署知情同意书，本研究由本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 主要试剂材料

TRIzol试剂和qRT-PCR Kit试剂盒购自日本TaKaRa公司；Bestar 1st Strand cDNA合成试剂盒购自上海DBIBioscience公司；miR-485-5p、SOX5、内参U6和β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HCC细胞Huh7购自上海中国科学院；高糖培养基、胎牛血清(fetal Bovine Serum, FBS)和胰酶购自美国Hyclone公司；pGL6-TA-SOX5-野生型质粒(SOX5-wt)、pGL6-TA-SOX5-突变型质粒(SOX5-mut)、miR-485-5p mimic和过表达SOX5质粒购自上海吉凯基因有限公司；双荧光素酶报道基因检测试剂盒购自北京索莱宝试剂有限公司；CCK8试剂购自日本同仁化学；Transwell小室购自美国coring公司；蛋白裂解液和BCA检测试剂盒购自美国Thermo公司；PVDF膜购自迈博瑞生物膜技术有限公司；pAkt(66444-1-Ig，1 ∶2 000)抗体购自美国proteintech公司和pGSK3β(ab75814，1 ∶1 000)抗体购自英国Abcam公司。

1.3 细胞培养和转染

Huh7快速复苏后立即重悬至高糖培养基中，FBS浓度为10%。细胞培养在37 ℃、5% CO的全湿度培养箱中。细胞生长状态较好时，胰酶消化收集细胞，以每孔1×10个细胞传至6孔板中，分为NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组。细胞接种12 h后采用lip2000进行各组转染，无关序列对照转染NC组细胞，miR-485-5p 模拟物(mimic)转染miR-485-5p mimic组细胞，miR-485-5p mimic和过表达SOX5质粒同时转染miR-485-5p mimic+oe-SOX 5组细胞，放至培养箱中培养48 h后进行后续实验。

1.4 qRT-PCR

HCC组织研磨成粉末后，加入TRIzol试剂，冰上完全裂解，提取组织中的总RNA。Huh7细胞长满后，PBS洗1遍，加入TRIzol试剂，提取细胞中总RNA。测得RNA的浓度和纯度后。按照85 ℃、5 s，37 ℃、15 min反应条件采用逆转录试剂盒体系将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按照95 ℃预变性5 s，40个95 ℃变性5 s、65 ℃退火延伸34 s反应条件，采用qRT-PCR试剂盒体系测得各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，按照2公式以U6为内参计算HCC组织和细胞中miR-485-5p的相对表达量，以β-actin为内参计算SOX5 mRNA的相对表达量。miR-485-5p引物序列F: 5′-AGAGGCTGGCCGTGATG-3′, R: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。SOX5引物序列F: 5′-CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG-3′, R: 5′-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3′。U6引物序列F: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, R: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。β-actin引物序列F: 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′, R: 5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.5 双荧光素酶报告实验

TargetScan7.1在线软件(http://www.targetscan.org/)预测miR-485-5p可能的靶基因。以1.4中的cDNA为模板，通过PCR扩增包含miR-485-5p结合位点的SOX 5 3'UTR片段，SOX5引物进行SOX5基因片段扩增，采用XbaI和XhoI双酶切位点将扩增的SOX5片段插入到pGL6-TA质粒中荧光素酶基因的下游，获得pGL6-TA-SOX5-野生型质粒(SOX5-wt)。以同样的方法将突变片段插入到pGL6-TA质粒中，获得pGL6-TA-SOX5-野生型质粒(SOX5-wt)。Huh7细胞长满时，胰酶消化收集细胞，以每孔2 000个传至96孔板中，分为NC+SOX5-wt组(无关序列对照与SOX5-wt质粒同时转染)、miR-485-5p+SOX5-wt组(miR-485-5p mimic与SOX5-wt质粒同时转染)、NC+SOX5-mut组(无关序列对照与SOX5-mut质粒同时转染)、miR-485-5p+SOX5-mut组(miR-485-5p mimic与SOX5-mut质粒同时转染)，放至培养箱中培养48 h。按照双荧光素酶报道基因检测试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.6 CCK-8实验

Huh7细胞长满后，PBS洗1遍，胰酶消化收集细胞，以每孔1 500个细胞传至96孔板中，分为NC、miR-485-5p mimic和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组，按上述转染的方法进行各组细胞的转染。分别在细胞转染0、24、48和72 h时，每孔加入10 μl CCK-8试剂，放置培养箱中继续培养2 h。酶标仪检测490 nm处各样品的吸光度值。

1.7 Transwell实验

胰酶消化收集转染48 h的各组细胞，无血清高糖培养基洗2次，以1×10个细胞重悬至100 μl无血清高糖培养基中。细胞悬液加入到Transwell小室中，并将Transwell小室放入加有500 μl含有10% FBS的完全培养基中。放置37 ℃、5% CO的全湿度培养箱中培养。12 h左右终止培养，PBS将未穿过的细胞洗去后，甲醇固定细胞，苏木精进行染色，显微镜下拍照，计数细胞穿膜的个数。

1.8 Western blot检测蛋白表达

胰酶消化收集转染48 h的各组细胞，PBS洗1遍后，加入蛋白裂解液，超声裂解30 min，14 000 r/min、4 ℃离心30 min。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。加入上样缓冲液后煮沸蛋白变性。定量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白经湿性转膜方法转移至PVDF膜上，5% BSA常温孵育PVDF膜1 h，pAkt、pGSK3β 和内参GAPDH一抗稀释液4 ℃孵育过夜，二抗稀释液室温孵育1 h，ECL试剂盒曝光蛋白条带。

2 结果

2.1 miR-485-5p对SOX5的靶向调控作用

TargetScan 7.1软件在线预测显示SOX5的3′UTR与miR-485-5p具有结合位点，见图1A。双荧光素酶报告基因试验结果显示：与NC+SOX5-wt组相比，miR-485-5p+SOX5-wt组的荧光素酶活性降低(

t

=4.031,

P

=0.021)；而NC+SOX5-mut和miR-485-5p+SOX5-mut组间的荧光素酶活性差异无统计学意义(

t

=1.052,

P

=0.067)，见图1B。

图1 miR-485-5p对SOX5的靶向调控作用

2.2 miR-485-5p和SOX5在HCC组织中的表达水平

qRT-PCR检测结果显示与癌旁组织相比，HCC组织中miR-485-5p的表达降低(

t

=2.747,

P

=0.008)。与癌旁组织相比，HCC组织中SOX5 mRNA的表达增加(

t

=5.697,

P

<0.001)，见图2。

2.3 miR-485-5p和SOX5在HCC组织中表达的相关性

采用Pearson线性相关分析检测HCC组织中miR-485-5p与SOX5的表达相关性，按照miR-485-5p在HCC组织中的平均相对表达量0.73为界，将40例HCC患者分为miR-485-5p高表达(18例)和miR-485-5p低表达(22例)。SOX5在HCC组织中的平均相对表达量1.43为界，将40例HCC患者分为SOX5高表达(19例)和SOX5低表达(21例)，结果显示miR-485-5p与SOX5在HCC组织中的表达呈负相关(

r

=-0.701，

P

=0.004)。

2.4 各组细胞转染效率的检测

Huh7转染miR-485-5p mimic，与NC组相比，miR-485-5p mimic组中miR-485-5p的表达增加(

t

=6.331,

P

=0.010)，表明miR-485-5p mimic成功转染HCC细胞，见图3A。与NC组相比，miR-485-5p mimic组细胞中SOX5 mRNA的表达降低(

t

=4.050,

P

=0.018)，表明miR-485-5p负调控SOX5的表达，见图3B。Huh7转染SOX5过表达质粒，与NC组相比，oe-SOX5组细胞中SOX5蛋白的表达增加(

t

=8.041,

P

<0.001)，见图3C。表明SOX5过表达质粒成功转染HCC细胞。

图2 qRT-PCR检测miR-485-5p和SOX5在HCC组织中的表达水平

2.5 miR-485-5p调控SOX5对HCC细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，与NC组相比，miR-485-5p mimic组和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞活力降低。而与miR-485-5p mimic 组相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞活力增加，SOX5 减弱miR-485-5p mimic对HCC细胞活力的抑制作用。见图4。

2.6 miR-485-5p调控SOX5对HCC细胞迁移侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，NC组Huh7细胞穿膜数为(128.33±10.57)个，miR-485-5p mimic组Huh7细胞穿膜数为(32.67±3.84)个，miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞穿膜数为(64.33±9.78)个。与NC组相比，miR-485-5p mimic组和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞迁移侵袭能力降低(

t

=13.871,

P

<0.001；

t

=5.952,

P

=0.009)。与miR-485-5p mimic 组相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞迁移侵袭能力增加(

t

=4.863,

P

=0.012)，SOX5 减弱miR-485-5p mimic对HCC细胞迁移侵袭能力的抑制作用。见图5。

图3 各组细胞转染效率的检测

图4 miR-485-5p调控SOX5对Huh7细胞活力的影响

图5 miR-485-5p调控SOX5对Huh7细胞迁移侵袭能力的影响 ×200

2.7 miR-485-5p调控SOX5对Akt/GSK3β的影响

Western blot实验结果显示，与NC组相比，miR-485-5p mimic组和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞中pAkt和pGSK3β蛋白表达降低。与miR-485-5p mimic 组相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5组Huh7细胞中pAkt和pGSK3β蛋白表达增加，SOX5 减弱miR-485-5p mimic对Akt/GSK3β信号通路的抑制作用。见图6、表1。

图6 miR-485-5p负靶向调控SOX5对Akt/GSK3β的影响

表1 各组细胞中Akt/GSK3β信号通路蛋白的相对表达量

3 讨论

miRNA是长度约为18～25个核苷酸的一类小非编码单链RNA分子，包括恶性肿瘤在内的各种人类疾病中表达异常，并且被认为是抗肿瘤治疗的候选靶点。miR-485-5p位于14q32号染色体的人类基因组区域。miR-485-5p在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用，miR-485-5p在结直肠癌中低表达抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，并促进细胞的凋亡。miR-485-5p的表达显著抑制了食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。越来越多的证据集中在miR-485-5p在肿瘤发生发展过程中的功能上，Gao et al报道miR-485-5p在HCC中表达下调，并通过负调控WBP2抑制HCC细胞增殖、迁移侵袭能力和促进细胞凋亡。miRNA通过与它们靶基因的3'非翻译区结合来抑制其靶基因信使RNA的表达是miRNA发挥调控作用的重要机制，每个miRNA的靶基因可能存在成千上百个。TargetScan7.1软件是可以在线预测miRNA与其靶基因结合位点的网站，本文在此网站上发现miR-485-5p与SOX5 mRNA的3'非翻译区具有结合位点，并且采用双荧光素酶报道基因证实SOX5为miR-485-5p的靶基因。

SOX5是SOX家族转录因子的成员，具有高迁移率族DNA结合基序的保守序列，在调节胚胎发育和决定细胞命运方面具有重要作用。SOX5的最新研究主要集中在肿瘤上，在胰腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤中，促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和维持肿瘤干细胞干性等方面具有重要的作用。Wang et al报道SOX5在HCC组织和细胞系中表达上调，并通过调控上皮间质转化过程促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。双荧光素酶报道实验提示miR-485-5p可能通过调控SOX5在HCC中发挥作用。本文采用qRT-PCR检测显示与癌旁组织相比，HCC组织中miR-485-5p的表达显著下调，而SOX5的表达显著上调，与已有的研究一致。但是person相关分析显示，miR-485-5p与SOX5在HCC组织中的表达呈负相关，并且采用mimic转染HCC细胞过表达miR-485-5p后显示HCC细胞中SOX5 mRNA的表达降低，表明miR-485-5p靶向负调控SOX5。采用MTS和Transwell实验检测miR-485-5p调控SOX5在HCC中的生物学功能，结果表明与NC组相比，miR-485-5p mimic组和miR-485-5p mimic+oe-SOX5组HCC细胞的增殖和侵袭迁移能力降低，而与miR-485-5p mimic组相比，miR-485-5p mimic+oe-SOX5组HCC细胞的增殖和侵袭迁移能力增加，表明miR-485-5p通过负调控SOX5抑制HCC的细胞的恶性表型。为了进一步研究miR-485-5p调控SOX5发挥作用的机制，本文采用Western blot实验检测miR-485-5p调控SOX5对Akt/GSK3β信号通路的影响，Akt/GSK3β信号通路是与肿瘤增殖和侵袭迁移能力相关的肿瘤重要调控途径，包括HCC。Akt/GSK3β信号通路中关键蛋白Akt和GSK3β发生磷酸化激活(pAkt和pGSK3β)促使其下游信号分子发生促肿瘤发生发展的表达改变。本文结果显示SOX5减弱miR-485-5p对Akt/GSK3β信号通路活化的抑制作用。表明miR-485-5p负调控SOX5抑制Akt/GSK3β信号通路活化参与HCC的发生发展。

综上所述，miR-485-5p和SOX5的表达在HCC中呈负相关。miR-485-5p负调控SOX5抑制HCC细胞增殖和侵袭迁移能力，作用机制可能是通过抑制Akt/GSK3β信号通路的活化。miR-485-5p和SOX5可能是抗HCC治疗的分子靶标。