盐胁迫对3个越橘品种组培苗生长的影响与耐盐性评价

韦建辰，徐振彪，贾文飞，魏晓琼，李金英，王 颖，吴 林

(1吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118；2吉林省蓝莓研究中心，吉林 长春 130021；3山东理工大学 生命科学学院，山东 淄博 255049；4淄博普蓝农业科技有限公司，山东 淄博 256300)

1 材料与方法

1.1 材 料

剪取越橘品种‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’春季新生半木质化嫩茎，以其为外植体经过诱导并多次继代培养的组培苗[17]为试验材料。组培室培养条件为：温度(25±1) ℃，光周期16 h光照+8 h黑暗。

1.2 方 法

无菌环境下，3个越橘品种分别选取长势相近、健康无污染的同代组培苗,剪切为长度2 cm的茎段[18]，每个茎段至少带1片叶[19]，接种至NaCl浓度分别为0(CK)，15，30，45，60，75，90，105和120 mmol/L的改良WPM培养基中[20]，每瓶接种12个茎段，3瓶为1个重复，每个处理重复3次。25 d后记录及测量组培苗的生长状况及Na+和K+含量。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 越橘组培苗生长指标的测定 每个处理随机选取15株组培苗，去除培养基后使用电子天平称其鲜质量并取平均值；每个处理选取1株组培苗，水平放置，白炽灯光源下垂直拍照记录组培苗生长状态；使用游标卡尺测量15株组培苗长度不小于0.1 cm的新生芽长度并计算均值；记录新生芽个数和已死亡组培苗的株数，按下式计算芽增殖率及存活率。

芽增殖率=新生芽数/成活植株数×100%[21]；

存活率=1-(死亡植株数/测试植株数)×100%[22]。

1.3.2 越橘组培苗Na+和K+含量的测定 准确称取烘干并粉碎的各处理组培苗样品0.5 g，放入马福炉(550 ℃)中灰化4 h，然后用浓硝酸溶解，用原子吸收光度计测定Na+和K+含量[14]，并计算K+/Na+的比值。

1.4 3个越橘品种的耐盐性评价方法

1.4.1 单项指标耐盐系数[23]的计算 公式如下：

单项指标耐盐系数=不同NaCl浓度处理下的平均值÷对照(CK)测定值。

(1)

1.4.2 隶属函数值的计算 用隶属函数法[24]计算3个越橘品种的隶属函数值，若耐盐指标与耐盐性正相关，则计算公式为：

U(xi)=(xi-xi min)/(xi max-xi min),i=1,2,3,…,n；

(2)

若耐盐指标与耐盐性负相关，其计算公式为：

U(xi)=1-(xi-xi min)/(xi max-xi min),i=1,2,3,…,n。

(3)

式中：U为隶属函数值，xi为某项指标的测定值，xi min、xi max为所有试材中该指标的最小值和最大值。

1.4.3 耐盐性权重系数的计算 公式如下：

Wi=pi/∑pi,i=1,2,3,…,n。

(4)

式中：Wi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度，即权重；pi表示第i个综合指标的贡献率。

1.4.4 耐盐性综合指数的计算 公式[25]如下：

D=∑[U(xi)×Wi],i=1,2,3,…,n。

(5)

式中:D代表供试材料耐盐性综合指数。D越大表示其耐盐性越强，反之则越弱。

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2019对试验数据进行录入整理及图表制作，使用SPSS 21对数据进行主成分分析和数据统计分析，平均值间的比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)，多重比较采用邓肯氏多重范围检验(Duncan’s multiple range test)，显著性检验水平均设置为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaCl处理对越橘组培苗生长指标的影响

2.1.1 鲜质量与存活率 表1显示，3个越橘品种组培苗的单株鲜质量与存活率均随NaCl浓度的升高而呈降低趋势，当NaCl浓度大于60 mmol/L时，各越橘品种的鲜质量均较CK显著(P<0.05)降低。其中‘奥尼尔’的鲜质量对NaCl最为敏感，当NaCl浓度大于30 mmol/L时，鲜质量即较对照明显降低。NaCl浓度为120 mmol/L时，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的鲜质量分别较各自CK降低54.7%，51.0%和35.4%，其中‘密斯梯’鲜质量降幅最小，但其CK鲜质量也明显低于其他2个品种。

表1 不同浓度NaCl处理对3个越橘品种组培苗鲜质量与存活率的影响Table 1 Effects of different NaCl concentrations on fresh mass and survival rate of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

3个越橘品种组培苗的存活率随着NaCl浓度的增加而持续下降，当NaCl浓度在15～30 mmol/L 时，3个越橘品种组培苗的存活率均与CK无显著差异；NaCl浓度大于45 mmol/L时，‘奥尼尔’和‘密斯梯’组培苗的存活率与对照差异显著(P<0.05)，‘雷戈西’在NaCl浓度大于60 mmol/L时组培苗存活率较CK显著(P<0.05)降低；‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的最低存活率均出现在NaCl浓度为120 mmol/L 时，存活率分别较各自CK降低了20%，33%和40%，以‘密斯梯’的存活率降幅最大。

2.1.2 芽增殖率与新生芽长 分析表2得出，越橘组培苗的芽增殖率随NaCl浓度的升高呈下降趋势；‘雷戈西’在NaCl浓度为45～90 mmol/L时芽增殖率变化平稳，无显著差异(P>0.05)，在不同NaCl浓度下，其芽增殖率始终高于其他2个越橘品种；‘密斯梯’的芽增殖率较CK下降最多；NaCl浓度为120 mmol/L时，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的芽增殖率分别较各自CK降低83.3%，75.1%和96.1%。

表2 不同浓度NaCl处理对3个越橘品种组培苗芽增殖率与新生芽长的影响Table 2 Effects of different NaCl concentrations on bud proliferation rate and new shoots length of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

NaCl处理对越橘新生芽长度影响较大，随着NaCl浓度的升高，所有越橘品种的新生芽长均呈现下降趋势，其中对‘密斯梯’影响最大，当NaCl浓度增加至90 mmol/L以上时，该品种越橘组培苗的新生芽长均小于0.1 cm，导致其新生芽长数据缺失，说明此时NaCl浓度已经超过‘密斯梯’新生芽生长的耐受范围，生长受到了严重抑制。NaCl处理对其他2个越橘品种的影响也十分明显，当NaCl浓度分别大于30和15 mmol/L时，‘奥尼尔’和‘雷戈西’的新生芽长与CK差异显著(P<0.05)；NaCl浓度为120 mmol/L时，‘奥尼尔’和‘雷戈西’的新生芽长分别较各自CK降低84.1%和86.7%；不同NaCl浓度下，‘雷戈西’的新生芽长均高于其他2个越橘品种。

2.1.3 生长状态 由图1可知，组培苗茎段的新增高度主要由新生芽长度及其分生位置决定。随着NaCl浓度升高，‘奥尼尔’和‘雷戈西’植株叶片逐渐由绿变黄，老叶脱落现象逐渐加重，‘密斯梯’植株叶片颜色逐渐由绿色变为深褐色。

图1 不同浓度NaCl处理对3个越橘品种组培苗生长状态的影响Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on growth state of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

2.2 不同浓度NaCl处理对越橘组培苗Na+、K+含量及其比值的影响

2.2.1 Na+含量 由图2可知，随着NaCl浓度的升高，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’3个越橘品种组培苗植株中Na+含量均出现不同程度的增加，Na+含量分别在NaCl浓度为30，30，45 mmol/L时较CK出现显著增加(P<0.05)。NaCl浓度为120 mmol/L时，3种越橘的Na+含量均达到最高值，分别为各自CK的4.1，3.6和4.1倍，其中‘雷戈西’的增幅最小，且各个NaCl浓度下Na+含量均小于‘奥尼尔’和‘密斯梯’。

2.2.2 K+含量 从图3可以看出，3个越橘品种组培苗植株中K+含量随NaCl浓度的增加均呈下降趋势，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’植株中K+含量分别在NaCl浓度为30，60，30 mmol/L时较各自CK出现显著下降(P<0.05)。NaCl浓度为60 mmol/L时，3个越橘品种组培苗K+含量分别较CK下降10%，9%和15%；NaCl浓度为120 mmol/L时，K+含量均达到最低值，分别较各自CK下降20%，19%和27%，其中‘密斯梯’组培苗植株中K+含量下降最多。

柱上标不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) among treatments for same cultivars.The same below图2 不同浓度NaCl处理下3个越橘品种组培苗Na+含量的变化Fig.2 Changes of Na+ content in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

图3 不同浓度NaCl处理下3个越橘品种组培苗K+含量的变化Fig.3 Changes of K+ content in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

2.2.3 K+/Na+比 由图4可以看出，3个越橘品种组培苗中K+/Na+比值均随NaCl浓度的增加而下降，‘奥尼尔’、‘密斯梯’在各浓度NaCl处理下K+/Na+比值均显著低于各自CK(P<0.05)，‘雷戈西’在NaCl浓度大于30 mmol/L时K+/Na+比值较CK出现显著下降(P<0.05)。NaCl浓度为120 mmol/L时，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的K+/Na+比值分别较各自CK下降了80%，77%和83%。各浓度NaCl处理下，K+/Na+比由高到低均依次为‘雷戈西’、‘奥尼尔’、‘密斯梯’。

图4 不同浓度NaCl处理下3个越橘品种组培苗K+/Na+比值的变化Fig.4 Changes of K+/Na+ ratio in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

2.3 3个越橘品种耐盐性综合评价

根据所测得的各项指标数据，使用NaCl处理组和对照组各性状的平均值，用公式(1)计算出3个越橘品种组培苗各项指标的耐盐系数[26](表3)。植物的耐盐性由不同指标综合反映，而各单项指标所反映的侧重点不尽相同，所以为了全面评价植物耐盐性，应该对各单项指标进行综合分析评价[25]。

表3 不同越橘品种相关指标的耐盐系数Table 3 Salt tolerance coefficient of relative indexes of different blueberry cultivars

对3个越橘品种7个指标的耐盐系数进行主成分分析，共得到1个特征值大于1的主成分(表4)。由表4可知，第1主成分贡献率达到了86.73%，意味着主成分1能够反映原试验中7种不同指标的信息量，可初步作为一个新的综合指标对越橘组培苗的耐盐性进行评价[23]。

表4 越橘耐盐指标的主成分分析结果Table 4 Principal component analysis results of salt resistance index of blueberry

用公式(2)和(3)计算3种越橘各项指标的隶属函数值，根据主成分分析结果使用公式(4)和(5)计算出3个越橘品种的耐盐性综合指数(D)并进行排名(表5)。由表5可知，‘奥尼尔’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的耐盐性综合指数分别为0.46，0.66和0.24，说明试验中3个越橘品种的耐盐能力由大至小依次为‘雷戈西’、‘奥尼尔’、‘密斯梯’。

表5 3个越橘品种耐盐指标隶属函数值与耐盐性综合排名Table 5 Comprehensive ranking of membership function value and salt tolerance of 3 blueberry cultivars

3 结论与讨论

盐胁迫对植物形态发育方面的影响最为显著，最直观且普遍的就是抑制植株组织和器官的生长[27]。鲜质量的对比能够比较直观地反映各浓度盐胁迫下植株相应的生长状态，生物量也是植物耐盐性的重要判定指标之一[28]。本试验中，‘奥尼尔’在NaCl浓度为30 mmol/L时，鲜质量即较CK显著下降，NaCl浓度最高时鲜质量较CK降低了54.7%，是3个品种中降幅最大的；NaCl浓度为45～60 mmol/L时，3个越橘品种组培苗的存活率也较CK出现了显著下降。3个越橘品种的鲜质量和存活率随着NaCl浓度的升高呈下降趋势，说明NaCl浓度一旦超出越橘的耐受范围，组培苗的鲜质量和存活率就会受到明显影响，这与前人对越橘的研究结果一致[13,29]。

扩繁试验中，芽增殖率是最重要的评价指标之一[30]，新生芽长同样影响到扩繁质量的优劣。本试验中，越橘组培苗的芽增殖率和新生芽长对NaCl十分敏感，均随着NaCl浓度的增加而降低，当NaCl浓度为120 mmol/L时，3个越橘品种的芽增殖率和新生芽长均较CK大幅下降，其中‘密斯梯’在NaCl浓度为90 mmol/L时新生芽长便不足0.1 cm，说明盐胁迫会显著降低越橘组培苗的增殖能力，减缓新生芽的生长速度，不利于越橘的增殖扩繁。

盐胁迫还可以引起植物体内离子分布和水分流动失衡，造成渗透胁迫及离子毒害[31]，从而导致植物生长受阻，甚至死亡[32]。Na+是盐胁迫下主要的毒害离子，植物通常通过各部位对Na+的合理转运来减少盐害影响[33-34]。如果植物细胞胞质内Na+含量过多，会对植物体内的酶活性、新陈代谢和光合作用造成负面影响[35-36]。K+在植物细胞内的离子平衡中起重要作用，参与植物体内50多种酶的激活和蛋白质合成，如果植物体内Na+过多，会与K+竞争酶的结合位点，使酶失活，还会引起多种蛋白合成及酶促反应的阻断[37]。还有研究表明，Na+和K+的水合半径较为接近，植物对其吸收具有拮抗作用[38]，在盐胁迫下如果植物细胞中Na+大量积累则会抑制K+的吸收，使植物体内K+/Na+比下降，细胞为了维持K+/Na+比平衡，会有一定保留K+的能力[39]，因此K+/Na+比的高低也是衡量植物耐盐性的重要指标之一[40-41]。本试验中，与CK相比，随着NaCl浓度的升高，3个越橘组培苗中Na+含量逐渐增加，K+含量及K+/Na+比值呈不断下降的趋势，这与乌凤章等[10,14]对越橘幼苗进行盐胁迫得出的结果相同。其他学者在猕猴桃(Actinidiachinensis)[42]和甘蔗(GlycyrrhizaglabraL.)[32]等植物的盐胁迫研究中，也得到了同样的结果。

结合生长指标分析，Eerahim[43]研究表明，野生大麦(Hordeumvulgaressp.)的植株存活率与Na+浓度呈负相关，与叶片K+/Na+比呈正相关，这与本次试验结果一致。本试验中‘雷戈西’在各处理中Na+含量最低，K+含量随盐浓度增加的降幅最小，K+/Na+比高于‘奥尼尔’和‘密斯梯’，‘雷戈西’的鲜质量在NaCl浓度为15～75 mmol/L时也均大于其他2个品种，芽增殖率和新生芽长则始终高于另2个品种。

评价植物抗逆性的指标种类较多，且各指标间存在一定的相关性和重叠性，所以将各指标结合起来综合分析植物耐盐性更为合理[25]。本研究使用主成分分析法将不同NaCl浓度处理下越橘植株的7个生长和生理指标转换成1个综合指标，结合隶属函数法综合分析了3个越橘品种的耐盐性，在一定程度上避免了单一指标难以准确判断植物耐盐性强弱的问题[26]。

综上所述，NaCl胁迫对越橘组培苗的生长和增殖有抑制作用，能显著降低越橘组培苗的鲜质量和存活率，降低芽增殖率并减缓新生芽的生长速度；随着NaCl浓度的升高，越橘组培苗植株内Na+含量逐渐增加，K+含量及K+/Na+比不断下降；3个越橘品种组培苗的耐盐能力从强到弱依次为‘雷戈西’、‘奥尼尔’、‘密斯梯’。