氯喹通过阻断肿瘤坏死因子受体相关因子3自噬性降解抑制类风湿关节炎滑膜细胞活化

吕昌伟 和晶 张乾 郗海涛 强毅 张静涛

西北大学附属医院/西安市第三医院骨科（西安710018）

类风湿性关节炎是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，最终可导致骨关节损伤甚至残疾［1］。类风湿性关节炎病理改变以慢性滑膜炎和骨关节结构损害为特征，其发病机制尚未明确，目前并无完全有效的根治方法［2］。近来的研究显示，纤维样滑膜细胞（fibroblast⁃like synoviocyte，FLS）的异常活化在类风湿性关节炎的发展中发挥了关键作用，其可通过产生炎性因子引起滑膜炎症和病理损伤［3］。活化的FLS表现出过度增殖，并产生多种炎症因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），如TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6、CXCL10、MMP⁃2和MMP⁃9，造成关节的慢性炎症和持续性破坏［4］。肿瘤坏死因子受体相关因子3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）是属于肿瘤坏死因子受体作用因子超家族成员，是细胞内一种重要的负性调控蛋白，包括抑制CREB、NF⁃κB和STAT3信号［5］。NF⁃κB信号的异常激活可引起持续高强度炎症，导致IL⁃6、MMP⁃2、MMP⁃9、CXCL10等多种炎性因子水平升高，诱发多种自身免疫性疾病［6］，并在FLS的激活中发挥了重要作用［4］。

目前，氯喹用于类风湿性关节炎治疗取得了较好的疗效，但其作用机制尚不明确。本研究探讨氯喹对FLS异常激活的抑制作用，并通过探讨氯喹对TRAF3蛋白水平的影响，以及对TRAF3自噬性降解的影响，以期阐明氯喹抑制FLS活化的分子机制，为氯喹治疗类风湿性关节炎的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理类风湿关节炎滑膜细胞（MH7A）于重庆巴而思生物科技有限公司购买，采用RPMI⁃1640培养基（Gibco，美国）补充10%胎牛血清（AusGeneX，澳大利亚）和1%青链霉素（碧云天，中国）进行培养。采用TNF⁃α预处理建立类风湿关节炎滑膜细胞活化模型，即除对照组外，所有MH7A细胞接受5 ng/mL的重组人THF⁃α（BBI，中国）预刺激24 h。根据实验，分别采用20 μmol/L氯喹（MCE，美国）、10 μmol/L雷帕霉素（Rapa，MCE）和10 μmol/L蛋白酶体抑制剂MG⁃132（MCE）处理细胞24 h。siRNA干扰TRAF3表达细胞，进行siRNA转染后，进行上述药物处理。

1.2 si⁃RNA转染使用不含青霉素/链霉素的RPMI⁃1640培养基接种细胞至6孔板，培养12 h。将TRAF3 siRNA（Santa Cruz，美国）溶于optiMEM培养基（Gibco），将相应体积lipofectamin 2000（In⁃vitrogen，美国）溶于optiMEM培养基中，将配制好的siRNA溶液和lipofectamin 2000溶液等体积混合，室温稳定20 min，加入4倍体积新鲜optiMEM培养基混匀。吸出细胞旧培养基，每孔加入1 mL配制好的siRNA转染液，细胞培养箱中孵育5 h，换为正常培养基，继续培养24 h后用于后续实验。

1.3 细胞增殖检测细胞处理结束后，采用CCK⁃8试剂（碧云天）检测细胞增殖。吸出旧培养接，使用新培养基配制CCK⁃8溶液，加入各处理孔，37℃培养箱放置1 h，使用酶标仪（TECAN，瑞士）在450 nm测定吸光度。

1.4 Real⁃time PCR细胞处理结束后，RNAiso Plus（TaKaRa，中国）按照使用说明书提取总RNA，采用PrimeScriptRT Master Mix试剂盒（TaKaRa）按照说明书逆转录为cDNA。采用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒（TaKaRa）按照使用说明，进行real⁃time PCR检测。引物序列如下：GAPDH：forward 5′⁃AGGTCGGTGTGAACGGATT⁃3′，reverse 5′⁃AAT CTCCACTTTGCCACTGC⁃3′；TRAF3：forward 5′⁃AC⁃ATCCGCCTAGCCGACATGG⁃3′，reverse 5′⁃CTGCT⁃TCCGCCGCTTGTAGTC⁃3′。

1.5 ELISA检测细胞处理结束后，收集细胞培养上清，采用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中促炎因子含量。IL⁃6和CXCL10 ELISA检测试剂盒订购于博士德生物，按照产品说明书进行操作。

1.6 Western blot细胞处理结束后，RIPA裂解液（碧云天，中国）提取蛋白，BCA蛋白测定试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度，加入4×Laemmli上样缓冲液（Bio⁃Rad，美国），97.5℃变性10 min。SDS⁃PAGE凝胶电泳，转模后5%脱脂奶粉室温封闭，洗膜后分别孵TRAF3一抗（1∶1 000，CST，美国）、LC3一抗（1∶1 000，CST）、MMP⁃2一抗（1∶1 000，Protein⁃tech）、MMP⁃9一抗（1∶1 000，Proteintech），β⁃actin一抗（1∶2 000，CST），4℃过夜。洗膜后羊抗鼠和羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室温孵育1 h，化学发光，ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统（Bio⁃Rad）中曝光检测。

1.7 统计学方法结果数据采用（）表示，采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。两组数据之间的比较采用t检验，多组数据之间的比较采用单因素方差分析并跟以Fisher′s post hoc检验进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯喹抑制类风湿关节炎滑膜细胞活化相比对照组，TNF⁃α刺激导致了MH7A细胞IL⁃6和CX⁃CL10分泌显著增加（图1B、C），并且引起了MH7A细胞侵袭蛋白MMP⁃2和MMP⁃9表达增加（图1D），表明TNF⁃α预刺激有效引起了MH7A细胞活化。与TNF组相比，氯喹处理显著抑制了MH7A细胞增殖（图1A），降低了TNF⁃α引起的IL⁃6和CXCL10分泌（图1B、C），以及MMP⁃2和MMP⁃9表达（图1D）。这些结果表明，氯喹可显著抑制类风湿关节炎滑膜细胞活化。

图1 氯喹抑制MH7A纤维样滑膜细胞活化Fig.1 Chloroquine inhibits the activation of MH7A fibroblast⁃like synoviocytes

2.2 氯喹引起MH7A细胞TRAF3蛋白含量升高TNF⁃α刺激和氯喹处理均未引起MH7A细胞TRAF3 mRNA表达的变化（图2A），表明氯喹并不引起TRAF3基因表达水平的改变。然而，Western blot结果显示。氯喹处理可导致MH7A细胞内TRAF3蛋白含量显著升高（图2B）。这些结果提示，氯喹所致的TRAF3蛋白水平升高，并不是源于其基因表达的上调，而可能源于氯喹抑制了TRAF3的降解。

图2 氯喹引起MH7A滑膜细胞TRAF3蛋白表达升高Fig.2 Chloroquine increased the expression of TRAF3 protein in MH7A synoviocytes

2.3 TRAF3介导了氯喹对MH7A细胞活化的抑制通过TRAF3 siRNA下调MH7A细胞TRAF3蛋白表达，探讨TRAF3在氯喹抑制MH7A细胞活化中的作用。结果显示，si⁃TRAF3显著降低了MH7A细胞内TRAF3蛋白水平（图3A）。由结果可见，si⁃TRAF3可显著拮抗氯喹对MH7A细胞活化的抑制作用，阻断了氯喹对IL⁃6和CXCL10的分泌抑制（图3B、C），并解除了氯喹对MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达的抑制（图3D）。

2.4 氯喹抑制了TRAF3蛋白的自噬性降解进一步实验可见，氯喹可引起MH7A细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值降低（图4A），表明氯喹抑制了MH7A细胞自噬。自噬诱导剂雷帕霉素（RA）则显著增加了细胞自噬水平（图4A）。并且，雷帕霉素拮抗了氯喹的效应，导致MH7A细胞TRAF3蛋白水平明显降低（图4B）。此外，氯喹所致的TRAF3蛋白含量升高未被蛋白酶体抑制剂MG132进一步增强（图4B）。这些结果表明，氯喹可能主要通过抑制细胞自噬，阻断TRAF3的自噬性降解，导致了MH7A细胞TRAF3蛋白含量升高。

图3 TRAF3介导了氯喹对MH7A细胞的活化抑制Fig.3 TRAF3 mediated the inhibition of the activation of MH7A cells by chloroquine

图4 氯喹抑制MH7A细胞自噬和TRAF3蛋白自噬性降解Fig.4 Chloroquine inhibits autophagy of MH7A cells and autophagic degradation of TRAF3 protein

2.5 诱导自噬可拮抗氯喹对MH7A细胞的活化抑制采用自噬诱导剂雷帕霉素和氯喹共处理MH7A细胞。可见，与氯喹处理组相比，雷帕霉素可对抗氯喹作用，显著促进MH7A细胞IL⁃6和CX⁃CL10分泌增加（图5A，B），并引起MH7A细胞MMP⁃2和MMP⁃9蛋白水平升高（图5C）。这些结果进一步证实了氯喹通过阻止TRAF3自噬性降解抑制MH7A细胞活化。

图5 诱导自噬可拮抗氯喹对MH7A细胞的活化抑制Fig.5 Induction of autophagy antagonized the inhibition of MH7A cell activation by chloroquine

3 讨论

类风湿性关节炎的病理机制至今尚未明确，使得其缺乏确切有效的根治方法。近来，纤维样滑膜细胞（FLS）的异常活化在类风湿性关节炎的发病机理中获得了重视。FLS在类风湿性关节炎的多种病理进程中均发挥了关键作用，如滑膜炎症，血管翳生长，以及最终的软骨和骨破坏［7］。FLS在炎性滑膜的异常增生是类风湿性关节炎的典型特征［7］。这种细胞的增多源于FLS的大量增殖和凋亡减少［8］。另外，FLS被激活后可分泌基质金属蛋白酶，使细胞表现出侵袭特性，并导致关节组织破坏［7，9］。在类风湿性关节炎的滑膜炎症中，FLS激活同样发挥了重要作用。活化的FLS可分泌多种促炎因子，如IL⁃6、IL⁃1β和CXCL10等［10-11］，进而影响其他细胞和自身免疫反应性。本研究中，采用TNF⁃α预刺激建立FLS活化模型。结果可见，TNF⁃α预刺激可引起FLS细胞增殖，导致MMP⁃2和MMP⁃9蛋白表达升高，并引起IL⁃6和CXCL10分泌的增加，表明TNF⁃α刺激有效引起了FLS细胞的活化。

氯喹和羟氯喹已被应用于治疗轻中度类风湿性关节炎，以及重度类风湿性关节炎治疗时的联合用药［12］。虽然氯喹对免疫⁃炎症反应的抑制作用已被发现和报道，包括抑制免疫细胞增殖和活性，抑制炎症因子分泌，但对其治疗类风湿性关节炎的药理机制了解仍非常有限［13］。在本实验研究发现，氯喹处理可有效抑制FLS细胞的增殖、炎症因子分泌以及侵袭标志物MMP⁃2和MMP⁃9的表达，表明氯喹可有效抑制FLS的异常活化。这些结果表明，抑制FLS异常激活可能是氯喹治疗类风湿性关节炎的重要机制。同时，氯喹是一种高效的亲溶酶体抑制剂，可特异的抑制细胞溶酶体自噬途径［14］。自噬从多个方面参与了类风湿性关节炎的病理进程，包括FLS的存活、侵袭和凋亡抵抗［15］。最新的研究显示，抑制自噬可以提高类风湿性关节炎的治疗效果［16］。因此，氯喹可能通过抑制溶酶体自噬而发挥上述FLS活化抑制作用。本研究证实，氯喹处理可显著抑制FLS细胞自噬，表现为LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值的降低。

TRAF3是一种重要的炎症⁃免疫负性调控因子，其通过抑制多种信号通路而抑制免疫细胞活化，如NF⁃κB、IL⁃6R、CD40和CREB信号通路［5，17］。已有研究显示，激活TRAF3信号可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，并可减轻动物炎症反应［18-19］。本研究发现，氯喹能够增加MH7A细胞内TRAF3的蛋白含量，而干扰TRAF3表达阻断了氯喹对MH7A细胞活化的抑制，表明氯喹通过TRAF3增加抑制FLS活化。进一步研究发现，并且这种增加不是由于基因表达的增加。因此，氯喹可能通过抑制溶酶体自噬降解而实现TRAF3的蛋白含量升高。这一猜测被自噬诱导剂和蛋白酶体抑制剂实验证实。这些结果表明，氯喹通过阻断TRAF3溶酶体自噬降解，抑制FLS细胞活化。

NF⁃κB信号激活和类风湿性关节炎的滑膜病变程度程正相关，抑制NF⁃κB表达和信号激活，可显著抑制类风湿性关节炎的病情进展［20］，而增加NF⁃κB表达可加速类风湿性关节炎的侵袭进展［21］。NF⁃κB是TRAF3的主要负性调控信号通路，因此TRAF3对纤维样滑膜细胞活化的抑制可能藉由抑制NF⁃κB信号实现。

本研究从类风湿性关节炎纤维样滑膜细胞异常活化角度，阐明了氯喹治疗类风湿性关节炎的药理机制。氯喹长时间大剂量的类风湿性关节炎治疗应用可诱发不良反应，尤其是眼毒性［22］。因此，阐明氯喹治疗类风湿性关节炎的药理机制，有助于指导临床联合用药，降低药物剂量，有利于降低不良反应的发生。