慢性肾脏病血管钙化大鼠模型血清中HIF-1α、β-catenin 的表达及意义

陈琪琪，谭茹瑜，朱婷婷，张丽玲，欧三桃

（1.西南医科大学附属医院肾病内科，四川 泸州 646000；2.四川省肾脏病临床医学研究中心，四川 泸州 646000）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的发病率和患病率不断增加，已成为世界范围内严重的公共卫生问题［1］。心血管并发症是CKD 患者的首要死因，而血管钙化是CKD 患者心血管并发症的独立危险因素和预测因素之一［2］，是导致死于心血管并发症的终末期肾脏疾病患者（end stage renal disease，ESRD）增多主要原因之一［3，4］。CKD 血管钙化发生机制复杂且缺乏敏感的早期生物标志物，因此深入探索其机制，寻找新的血清学标志物十分必要。既往有学者发现Wnt/β-catenin 通路可能是CKD 血 管 钙 化 发 生 的 机 制 之 一［5，6］，且 钙 化 时 低 氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达也明显增加［7，8］，但血管钙化时血清HIF-1α、β-连环蛋白（β-catenin）水平变化如何，与血管钙化是否相关尚不明确。因此本研究旨在探索血管钙化大鼠血清HIF-1α、β-catenin 变化与血管钙化的关系，寻找敏感的血管钙化早期生物标志物。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30 只，体重180～270 g，6～8 周龄，购自西南医科大学动物实验中心，适应性饲养1 周后将其随机分为正常对照组（CON 组，10 只）和CKD 血管钙化组（CKD 组，20 只）。

1.2 试剂

腺嘌呤（Sigma 公司，美国），含磷1.2%的高磷饲料（北京科澳协力饲料有限公司，中国），戊巴比妥钠（Sigma 公司，美国），全组织冯库萨（Von kossa）钙染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司，中国），钙含量测定试剂盒（C004-2）（南京建成生物工程研究所，中国），大鼠HIF-1α、β-catenin ELISA 试剂盒（上海泛柯实业有限公司，中国），全自动生化分析仪（西门子，德国），全自动酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 CKD 大鼠血管钙化模型建立 CKD 组大鼠给予1.2% 高磷饲料喂养及2.5% 腺嘌呤250 mg/（kg·d）灌胃；对照组（CON 组）给予普通饲料喂养，并予以等量等频次生理盐水灌胃。第6 周末，收集尿液后处死大鼠，留取大鼠血液、肾脏及主动脉标本。

1.3.2 24 h 尿蛋白、血尿素、肌酐、钙、磷检测 留取24 h 尿检测大鼠24 h 尿蛋白量，腹主动脉采血并检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、钙（Ca）和磷（P），并计算钙磷乘积。

1.3.3 主动脉Von kossa 染色 GENMED 清理液清洗大鼠新鲜全段主动脉后加入GENMED 固定液，在室温下孵育1 h 后吸去固定液，清理液清洗2次后再次加入GENMED 染色液，孵育1 h 后清洗并加入平衡液，孵育5 min 后再次清洗，观察并拍照，黑色染色为阳性。

1.3.4 肾脏HE 染色 将肾脏包埋成石蜡块并切片，烤片，二甲苯、乙醇脱蜡脱水，蒸馏水洗5 min，重复2 次后苏木素染液染色5 min，冲洗，伊红染液染色3 min，冲洗，酒精、二甲苯脱水，封片，观察。

1.3.5 ELISA 法 检 测 血 清HIF-1α、β-catenin 水 平标准品及样品的稀释与加样；温育，洗涤，重复5 次，加酶，温育，洗涤，显色，终止，测定OD 值。计算标准曲线方程，据样品OD 值算出的样品浓度×稀释倍数=各样品的浓度。

1.3.6 主动脉钙含量检测 主动脉组织经液氮研磨、匀浆，留取上清液，配制工作液，按说明书将空白孔、标准孔、测定孔加样，混匀，静置，测定各孔在波长610 nm时的OD值。组织蛋白浓度采用BCA法测得。组织中钙含量（mmol/g prot）=（测定OD 值-空白OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准品浓度（1 mmol/L）÷样本蛋白浓度（mmol/g）。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肾功能及24 h 尿蛋白定量

与CON 组相比，CKD 组大鼠24 h 尿蛋白量、BUN、Scr 均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 大鼠血清钙（Ca）、磷（P）及钙磷乘积（Ca×P）

与CON组相比，CKD组大鼠血清磷、钙磷乘积均较CON组增高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01），血钙降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 两组大鼠肾功能、24 h 尿蛋白及生化指标水平（±s）Tab 1 The levels of renal function，24 h urine protein and biochemical indexes of rats in two groups（±s）

表1 两组大鼠肾功能、24 h 尿蛋白及生化指标水平（±s）Tab 1 The levels of renal function，24 h urine protein and biochemical indexes of rats in two groups（±s）

组别CON 组CKD 组n 10 20 tP 24 h 尿蛋白（g/24 h）0.00±0.00 0.02±0.00 9.086＜0.05 BUN（mmol/L)5.22±0.67 37.64±7.24 19.849＜0.05 Scr（μmol/L）33.50±2.28 145.45±31.99 15.569＜0.05 Ca（mmol/L）1.97±0.25 1.32±0.26 6.503＜0.05 P（mmol/L）2.56±0.86 6.62±0.86 12.126＜0.05 Ca×P（mmol2/L2）5.19±2.32 8.65±1.77 4.532＜0.05

2.3 大鼠主动脉钙化情况

肉眼观察见CON 组主动脉光滑柔软，富有弹性；CKD 组主动脉弹性差，质脆，管壁僵硬，表面凹凸不平，可见明显的节段性钙化结节。Von Kossa染色示：CON 组无黑色染色，CKD 组见黑色物质沉积在血管上，见图1。

图1 大鼠主动脉Von Kossa 染色Fig 1 Von Kossa staining of aorta of rats

2.4 肾脏病理改变

肾组织HE 染色示CON 组肾小球、小管及间质结构、形态未见异常。CKD 组大鼠肾组织形态结构紊乱，肾小球数量减少，部分萎缩伴囊腔扩张，见棕黄色物质沉积；肾小管扩张伴部分管腔断裂；肾间质呈纤维化改变，伴有炎性细胞浸润，见图2。

2.5 主动脉钙含量检测

与CON 组比较，CKD 组大鼠主动脉钙含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.6 血清HIF-1α、β-catenin 表达水平

与CON 组相比较，CKD 组大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表2 两组大鼠主动脉钙含量（±s）Tab 2 The levels of calcium content of aorta of rats in two groups（±s）

表2 两组大鼠主动脉钙含量（±s）Tab 2 The levels of calcium content of aorta of rats in two groups（±s）

组别CON 组CKD 组n 10 20 tP主动脉钙含量（mmol/g protein）0.14±0.05 0.34±0.15 4.079＜0.05

表3 两组大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平（pg/mL，±s）Tab 3 The levels of serum HIF-1α and β-catenin of rats in two groups（pg/mL，±s）

表3 两组大鼠血清HIF-1α、β-catenin 水平（pg/mL，±s）Tab 3 The levels of serum HIF-1α and β-catenin of rats in two groups（pg/mL，±s）

组别CON 组CKD 组n 10 20 t P HIF-1α（pg/mL）0.25±0.04 0.35±0.04 6.9＜0.05 β-catenin（pg/mL）0.24±0.02 0.46±0.01 35.509＜0.05

2.7 相关性分析

血清P、Ca×P、血清HIF-1α、β-catenin 水平与大鼠主动脉钙含量呈正相关（P＜0.05），而血Ca 与主动脉钙含量无显著相关性（P＞0.05），见表4。

表4 相关指标与主动脉钙含量的相关性分析Tab 4 Correlation analysis of related indexes and aortic calcium content

图2 两组大鼠肾脏HE 染色Fig 2 H & E staining of kidney sections of rats in two groups

3 讨论

血管钙化是CKD 患者心血管并发症的独立危险因素，导致CKD 患者心血管死亡率明显增加，但血管钙化发生机制复杂，目前临床上也缺乏早期识别血管钙化的生物标志物。本研究通过采用腺嘌呤灌胃及高磷饲料喂养的方法成功建立CKD 血管钙化大鼠模型，笔者发现血清HIF-1α 水平在CKD血管钙化大鼠组明显增高，且与主动脉钙含量呈正相关［9］。HIF-1α 是缺氧状态下介导下游基因表达的主要转录因子［10］，而多种肾脏疾病中普遍存在缺氧的情况，大量研究发现HIF 系统在多种肾脏疾病的发生发展起着重要作用，比如糖尿病肾病［11］、急性肾损伤、IgA 肾病等。同时，HIF-1α 通过调节血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨样细胞转分化、糖代谢途径、炎症、氧化应激、Notch 信号通路等多个机制参与CKD 的血管钙化［9］。有研究发现没有心血管疾病的糖尿病患者血清HIF-1α 水平随着其冠状动脉钙化（coronary artery calcification，CAC）程度的加重而明显增加，提示血清HIF-1α 可能可预测CAC 的发生及其严重程度［12］。一项有关维持性血液透析(MHD）患者的研究也发现患者血清中HIF-1α 水平明显升高，并且与冠状动脉钙化积分呈正相关［13］。本课题组的前期研究也发现CKD 大鼠主动脉上存在HIF-1a-VEGF-Notch 信号通路的激活。本研究与上述研究结果一致，这表明HIF-1α 可能可早期反映CKD 血管钙化的发生及其严重程度，甚至可能预测血管钙化的进展。但是由于HIF 也参与了CKD 肾性贫血、肾脏纤维化、微炎症状态等多种病理状态的发生，且其具体作用目前尚不明确，因此仍需进行后续研究进一步证实。

β-catenin 是Wnt 通路的效应分子，可与转录因子结合，激活下游一系列靶基因的表达［14，15］。Wnt/β-catenin 通路与ESRD 患者钙磷代谢的关系十分密切，而长期钙磷代谢紊乱可继发血管钙化［16］。有研究发现在高磷、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、β-甘油磷酸、高迁移率族蛋白B1 诱导的VSMCs 钙化模型中，β-catenin 的表达明显增加，而阻断β-catenin 的表达 则 可 以 改 善 甚 至 逆 转VSMCs 的 钙 化［5，17］。进 一步的体内研究发现人参皂苷Rb1 可以通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路减轻CKD 血管钙化［18］。有研究人员在ESRD 患者的血管中发现了Wnt/βcatenin 通路的激活，且β-catenin 的表达随血管钙化的加重而增加［19］。本研究发现CKD 血管钙化大鼠血清β-catenin 水平明显高于CON 组，且与主动脉钙含量呈正相关，这表明不仅是组织中，血清的βcatenin 水平可能也参与了CKD 血管钙化的发生，可能可一定程度上反映血管钙化的存在，未来可进一步探索血管钙化患者的血清β-catenin 水平与钙化的关系。

综上，针对CKD 血管钙化目前仍缺乏有效的诊治手段及早期敏感的血清学标志物，而本研究发现CKD 血管钙化大鼠中，其血清HIF-1α、β-catenin 水平明显增高，且与主动脉钙化程度密切相关，有望成为预测、评价CKD 血管钙化的血清学指标，对防治CKD 血管钙化具有重要意义。