药对治疗新型冠状病毒肺炎邪犯肺卫证作用机制的网络药理学探讨

任 星，杨 静，2，张菀桐，高 蕊

（1.中国中医科学院西苑医院，北京100091；2.北京中医药大学研究生院，北京100029）

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒感染导致的以潜伏期长、传染性强、各类人群普遍易感为特点的传染性疾病［1］。COVID-19 在临床上主要表现为不明原因的发热、咳嗽、气促、呼吸困难及肺部感染症状，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭甚至死亡，其主要传播途径为呼吸道传播。随着疾病的蔓延，全球多个国家及地区相继出现确诊病例［2，3］。目前治疗上主要以抗病毒治疗及对症支持治疗为主，尚无特效药，对人类健康、经济和社会带来巨大的不良影响。

COVID-19 属 中 医“疫 病”、“瘟 疫”范 畴［4］。《黄帝内经》记载：“五疫之至，皆相染易，无问大小，病状相似”，并将传染性强、症状相似的一类外感热病称之为“疫病”［5］。中医对于疫病的治疗有其独特的优势，针对病变过程中出现的热（火）、寒、湿、毒、滞、结、瘀、燥、虚等病机变化，分别治以清解、散寒、化湿、解毒、祛痰、导滞、攻结、化瘀、润燥、补虚等法。COVID-19 发生于冬春季节，病邪多从口鼻而入，致肺失宣降、表气郁闭等病机变化，符合清代医家叶天士“温邪上受，首先犯肺”和清代医家吴鞠通“风温者，初春阳气始开，厥阴行令，风夹温也”等认识［6］。因此，卫气营血辩证体系同样适用于COVID-19 的辨证论治。针对病变过程中的病机变化，如邪犯肺卫证，选用药如金银花、连翘等，主以疏表透邪，清宣肺热［7］。近期的一些回顾性研究及病例报告提示中医药对于防治新冠肺炎可能具有积极作用。多项临床试验［8-10］表明连花清瘟胶囊治疗COVID-19 有较好的临床疗效，且安全性较高。金银花、连翘作为连花清瘟胶囊主要组成药物，治疗COVID-19 初期发热、咳嗽、鼻塞、咽痛等邪犯肺卫症状有良好的效果。金银花-连翘药对治疗COVID-19 的作用机制尚不明确，需进一步探讨。

网络药理学作为研究中药单体及复方的作用及作用机制的新兴学科，通过对药物成分、作用靶点及对应疾病等信息进行数据整合及建模的方式进行分析［11，12］。本研究基于网络药理学的方法筛选出金银花、连翘中药物成分及作用的靶点，预测与金银花-连翘药对主要作用靶点相关的疾病，构建靶点网络，并进行功能及通路富集分析。初步探索金银花-连翘药对治疗COVID-19 相关的物质基础及作用机制。

1 材料与方法

1.1 获取金银花-连翘药对药物作用靶点

登录TCMSP 数据库，搜索并获取金银花-连翘的药物化学成分，以生物利用度（OB）≥30%，类药性≥0.18 为条件进一步筛选金银花和连翘的有效化合物。根据药物已知成分，在TCMSP 及Gene-Cards 数据库获取成分作用靶点，将获取的靶点进行去重处理，排除重复靶点。运用Uniprot 数据库査询靶点蛋白对应的基因简称，得到金银花-连翘药对作用靶点并运用Cytoscape 软件构建药物成分-候选靶点网络图。

1.2 获取COVID-19 相关靶点

登录GeneCards 数据库，以“Novel coronavirus pneumonia”为关键词，人类基因为背景，筛选数据库中COVID-19 疾病相关作用靶点，获取疾病相关基因。

1.3 金银花-连翘活性成分―COVID-19 疾病靶点网络构建

运用Funrich 软件的韦恩图功能，将药物成分的候选靶点与COVID-19 疾病相关作用靶点取交集，得到金银花-连翘药对有效成分治疗COVID-19 的靶点，应用Cytoscape 软件构建金银花-连翘活性成分-COVID-19 疾病靶点网络，并进行可视化分析。

1.4 生物进程及KEGG 通路分析

将上述获得的金银花-连翘药对有效成分治疗COVID-19 的相关靶点导入DAVID 数据库中，进行GO 生物学进程及KEGG 通路富集分析。

2 结果

2.1 金银花-连翘药对药物化学成分筛选

登录TCMSP 数据库，以金银花、连翘为检索词，以生物利用度（OB）≥30%，类药性≥0.18 为条件筛选得到42 个化合物，筛选部分结果见表1。

2.2 金银花-连翘药对药物候选靶点筛选

将上述获得的42 个金银花-连翘药对活性成分引入TCMSP 数据库及GeneCards 数据库，获得35个活性成分对应139 个作用靶点（其中有7 个活性成分的疾病靶点未被TCMSP 数据库及GeneCards数据库收录）。将上述获得的金银花-连翘药对作用靶点输入到Uniprot 数据库中査询靶点蛋白对应的基因简称，剔除非人源靶标后最终得到金银花-连翘药对作用的疾病靶点135 个。并运用Cytoscape 软件构建药物活性成分候选靶点网络，如图1。

该网络共包含170 个节点，955 条边。其中16个橘黄色节点代表金银花活性成分，15 个黄色节点代表连翘活性成分，4 个紫色节点代表金银花与连翘共有活性成分，135 个蓝色节点代表活性成分作用的靶点，955 条边代表活性成分与靶点之间具有的相互作用关系。该网络图表明金银花-连翘药对中有多种药物成分作用多个靶点，符合中药多成分多靶点的特性。

表1 金银花-连翘药对部分活性成分一览表Tab 1 The active ingredients of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

图1 金银花-连翘药对活性成分候选靶点网络图Fig 1 Network diagram of candidate targets of active ingredients of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

2.3 COVID-19 候选靶点筛选

应用GeneCards 数据库，以“Novel coronavirus pneumonia”为关键词检索，获得COVID-19 相关基因靶点共259 个。

2.4 金银花-连翘药对成分―COVID-19 靶点网络构建

运用Funrich 软件的韦恩图功能，将药物成分的候选靶点与COVID-19 疾病相关靶点取交集，获得金银花-连翘药对作用于COVID-19 疾病的26 个靶点。见图2。

应用Cytoscape 软件构建金银花-连翘活性成分―COVID-19 疾病靶点网络，见图3。该网络包含52 个节点，262 条边。其中26 个橘黄色节点代表金银花-连翘药对活性成分，形状越大表示该成分的degree 值（在网络中，一个节点的degree 值表示网络中和节点相连路线的条数）越高；26 个蓝色节点代表金银花-连翘药对作用于COVID-19 的靶点（基因简称），并且形状越大表示该靶点的degree 值越高。在化合物方面，由图可见其中3 个化合物的degree值较大，分别是 MOL000006 木樨草素、MOL000422 山奈酚和MOL000098 槲皮素。说明在金银花-连翘药对治疗COVID-19 的过程中，起主要作用的是木樨草素、山奈酚、槲皮素3 种活性成分。在药物作用靶点方面，由图可知PTGS2、DPP4、NOS2、PPARG、PTGS1、MAPK14 等 靶 点的degree 值较大，说明金银花-连翘药对治疗COVID-19 的过程中主要作用于上述靶点。这体现了金银花-连翘药对多成分与多靶点之间共同作用的机制。

图2 金银花-连翘药对作用靶点和COVID-19 靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of the drug pair Lonicera japonica-forsythia active and COVID‑19 targets

2.5 金银花-连翘药对与COVID-19 相互关系的GO 生物进程及KEGG 通路富集分析

将金银花-连翘药对作用于COVID-19 的26 个基因靶点通过DAVID 数据库进行GO 生物进程及KEGG 通路富集分析，得到金银花-连翘药对治疗COVID-19 相互关系的生物进程及KEGG 通路结果。

2.5.1 生物进程聚类分析结果 通过GO 生物进程分析，见图4，可得知金银花-连翘药对治疗COVID-19 可能主要是通过参与影响以下体内生物进程相关：（1）细胞凋亡过程的正调控（positive regulation of apoptotic process）；（2）基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）；（3）MAPK级联反应（MAPK cascade）；（4）细胞对脂多糖（cellular response to lipopolysaccharide）等。由此可知，金银花-连翘药治疗COVID-19 主要体现在调控细胞凋亡和基因表达，诱发MAPK 级联反应等方面。

2.5.2 KEGG 聚类分析结果 为进一步探究金银花-连翘药对治疗COVID-19 的具体机制，运用DAVID 数据库对金银花-连翘药对治疗COVID-19 的相关靶点进行代谢通路分析，见图5。由图可知，金银花-连翘药对治疗COVID-19 的基因靶点主要富集在癌症通路（pathways in cancer）、肺结核（tuberculosis）、甲型流感（influenza A）、乙型肝炎（hepatitis B）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）及缺氧诱导因子信号通路（HIF-1 signaling pathway）上。

图4 金银花-连翘药对治疗COVID-19 的GO 生物进程聚类分析结果Fig 4 Cluster analysis results of GO biological process in the treatment of COVID‑19 of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

图5 金银花-连翘药对治疗COVID-19 的KEGG 通路聚类分析结果Fig 5 Cluster analysis results of KEGG pathway in the treatment of COVID‑19 of the drug pair Lonicera japonica-forsythia

3 讨论

COVID-19 不仅具有广泛的流行性而且人群普遍易感，与《素问·刺法论篇》记载的“五疫之至，皆相染易，无问大小，病状相似”及明代医家吴又可《温疫论》中记载的“无问老少强弱，触之者即病”等论述相符。因此，COVID-19 可归于中医“疫病”的范畴［7］。中医药防治流感不仅可以通过调整机体免疫力从而达到防病的目的，也能够直接作用于病毒本身，具有疗效好、副作用少、作用范围广的特点［13］。该病初期多见发热、恶寒、咳嗽、乏力、脉数等症状，在卫气营血辩证中属邪犯肺卫证，多用银翘散治疗。金银花、连翘为银翘散君药，具有疏表透邪，清宣肺热的功效。现代药理研究表明，金银花、连翘亦有抗流感病毒的效果。

本研究运用网络药理学手段，通过分析金银花-连翘药对与COVID-19 分子网络在生物功能方面的异同，初步探索金银花-连翘药对治疗COVID-19 邪犯肺卫证的作用机制。金银花-连翘药对成分―COVID-19 靶点网络分析结果表明，金银花-连翘药对在治疗COVID-19 的过程中，作用最强的化合物是槲皮素、山奈酚和木犀草素。近年来，对槲皮素药理作用的研究表明，其具有抗炎、抗病毒和免疫调节等多种药理作用［14］。万巧凤等［15］研究发现槲皮素可抑制感染细胞Casepase-3 蛋白表达，拮抗病毒诱导的细胞凋亡，从而达到抗甲型H1N1 流感病毒的作用。槲皮素可抑制多种病毒对细胞的感染，并且能够抑制病毒在细胞内复制［16］。现代药理研究表明，山奈酚具有抗炎、抗菌、抗病毒以及增强机体免疫力等多种药理作用［17］。李妍等［18］研究表明，山奈酚通过下调NF-κB 信号通路的表达降低甲型H9N2 流感病毒所致急性肺损伤小鼠的炎症程度和氧化应激损伤，最终减轻流感病毒所致的急性肺损伤。木犀草素具有抗柯萨奇病毒、抗菌、抑制组织纤维化、免疫调节等作用［19］。邓东沅等［20］研究表明在体外环境下，流感病毒H1N1 感染A549 细胞激活凋亡通路后，木犀草素能通过降低相关基因表达，干预细胞凋亡，发挥抑制流感病毒的作用。综上，金银花-连翘药对治疗COVID-19 的主要活性成分具有抗炎、抗菌、抗病毒及免疫调节的作用，说明金银花-连翘药对治疗COVID-19 具有一定的物质基础，并具有多成分、多靶点的特点。

通过GO 生物进程聚类分析，可得知金银花-连翘药对治疗COVID-19 的基因主要富集在细胞凋亡过程的正调控、基因表达的正调控、MAPK 级联反应以及细胞对脂多糖的反应调节等生物进程中，提示金银花-连翘药对治疗COVID-19 主要体现在调控细胞凋亡和基因表达、诱发MAPK 级联反应等方面。KEGG 通路富集结果涉及癌症通路、肺结核、甲型流感、乙型肝炎、肿瘤坏死因子信号通路及缺氧诱导因子信号通路等，提示金银花-连翘药对可能通过这些通路起到治疗COVID-19 的作用。冠状病毒感染细胞后，为了在细胞内转录、翻译和装配下一代，病毒在应对细胞免疫应答的同时，还参与到许多其他细胞活动中。当细胞特定受体与病毒蛋白结合后，细胞立即启动凋亡程序。通过表达靶向蛋白，诱导细胞凋亡，抑制病毒的复制，可达到控制病毒的感染和传播的目的［21］。MAPK 家族作为一种重要的信号调节酶，连接细胞膜表面受体，调节决定性基因的表达，控制细胞适应、增殖、分化、存活和程序性细胞死亡等生理过程［22］。相关研究表明，TNF 信号通路主要作用于COVID-19 患者在免疫反应和炎症风暴中被激活的细胞因子，抑制活化的细胞因子，缓和免疫反应，消除炎症［23］。HIF-1 信号通路在抗病毒、介导能量代谢、炎症反应、血管生成以及维持干细胞特性等方面发挥重要作用［24］。

综上所述，金银花-连翘药对治疗COVID-19 的作用机制主要通过调控细胞凋亡和基因表达，抑制病毒复制，控制病毒的感染和传播；诱发MAPK 级联反应，抑制病毒细胞增殖、分化，减缓COVID-19发生、发展的进程。作用于肺结核、甲型流感、乙型肝炎、肿瘤坏死因子及缺氧诱导因子等通路上，起到抗病毒、抑菌退热、免疫调节的作用。本研究从网络药理学的角度阐述了金银花-连翘药对治疗COVID-19 的作用机制，鉴于网络药理学本身的局限性，后期应对主要活性成分和相关通路靶点进行验证，为临床相关治疗提供理论基础和有效证据。