高效液相色谱法测定产后康膏中盐酸益母草碱含量*

徐宁宁，朱辰奇，顾 依，景荣先，周 琴，沈惠明，陈志鹏，刘 馨△

（1. 南京海辰药业股份有限公司，江苏 南京 215000； 2. 南京医科大学附属苏州医院药学部，江苏 苏州215002； 3. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

产后恶露不绝表现为子宫收缩无力，阴道不规则出血，伴血块或坏死蜕膜组织成分经阴道排出，持续10 d以上者，会导致感染甚至败血症［1］。产后康膏处方来源于卫生部部颁药品标准（中药成方制剂第十五册），用于治疗产后或流产后贫血和恶露不净，疗效显著。产后康膏由益母草、黄芪、党参、当归、丹参、神曲、陈皮、香附、乌药、木香、生地黄、熟地黄、砂仁、杜仲、泽泻、甘草、白芍、山楂、谷芽、麦芽20 味中药组方。君药益母草味苦、辛，性微寒，用于月经不调，痛经、经闭、恶露不尽，水肿尿少等，对子宫收缩和凝血系统具有双向调节作用［2－5］。《本草衍义》中记载益母草“治产前产后诸疾，行血养血”，《本草蒙筌》中记载益母草“去死胎，安生胎，行瘀血，生新血”［6－8］。产后康膏在部颁药品标准中仅以薄层色谱鉴别和膏剂密度作为检查项，不利于药品质量的控制，有必要寻求新的检查项，在符合院内制剂快速检查要求的同时，提高产后康膏质量标准。本研究中以盐酸益母草碱作为产后康膏的指标成分，采用高效液相色谱法测定不同批次产后康膏中盐酸益母草碱的含量，以作为其质量控制方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BS－124S 型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；LC－2010A HT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；MicroCL 型离心机（美国赛默飞世尔公司）；SynergyUV 型纯水仪（美国密理博公司）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为50 kHz）。

1.2 试药

甲醇、乙腈（色谱纯，加拿大Calepure 公司）；磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；盐酸益母草碱对照品（含量大于98%，中国食品药品检定研究院，批号为110823－201807）；产后康膏（苏州市立医院院内制剂，批号分别为20200414，20200420，20200426）；水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100－S－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液（22 ∶78，V／ V）；流速：1.2 mL／min；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；柱温：20 ℃。

2.2 溶液制备

取样品2.64 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，超声处理（功率为250 W，频率为33 kHz）30 min，称定质量，用甲醇补足减失的质量，即得供试品溶液。以处方工艺制备不含益母草的样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取盐酸益母草碱对照品适量，精密称定，置10 mL 棕色容量瓶中，加75%甲醇制成质量浓度为1.125 mg／mL 的对照品溶液，置4 ℃避光保存。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下3 种溶液，加75%甲醇稀释，0.45 μm 微孔滤膜滤过，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果见图1。可见，相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，与对照品溶液色谱对应位置上有相同保留时间的色谱峰，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：取2.2 项下对照品溶液，用75%甲醇稀释成质量浓度为1.125 0，0.562 5，0.225 0，0.112 5，0.022 5，0.004 5 mg／mL 的系列对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，按2.1 项下色谱条件进样测定，以质量浓度（X，mg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y ＝15 161 107.99 X ＋15 832.73，R2＝0.999 9（n ＝6）。结果表明，盐酸益母草碱质量浓度在0.004 5 ～1.125 0 mg／mL 范围与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取样品（批号为20200414），依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，重复进样6 次，记录峰面积。结果的RSD 为0.29%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20200414），依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算盐酸益母草碱含量。结果的RSD 为1.37%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20200414），依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时进样测定，计算盐酸益母草碱峰面积。结果的RSD 为0.96%（n ＝8），表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

加样回收试验：取样品（批号为20200414）适量，平行6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，进样测定，并计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取 3 批（ 批 号 分 别 为 20200414，20200420，20200426）样品，依法制备供试品溶液，平行3 份，进样，测定峰面积，用外标法计算含量。结果见表2。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

表1 盐酸益母草碱加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of leonurine hydrochloride（n ＝6）

表2 样品中盐酸益母草碱含量测定结果（n ＝3）Tab.2 Content determination of leonurine hydrochloride in different batches of Chanhoukang Paste（n ＝3）

3 讨论

3.1 指标成分选择

益母草碱是产后康膏方中君药益母草的主要有效成分，通过抗血小板凝聚达到活血化瘀的作用，直接清除自由基和抑制活性氧（ROS）的产生。通过核因子激活的B 细胞的κ－轻链增强（NF－κB）信号通路，抑制肿瘤坏死因子－α（TNF－α）介导的炎症，可减轻大肠杆菌诱导的乳腺炎［9－15］。因此，选择盐酸益母草碱作为产后康膏的指标成分。研究结果表明，盐酸益母草碱含量较高，稳定性较好，可作为指标成分。

3.2 样品处理方式选择

前期研究中，选择甲醇超声提取、乙醇超声提取和乙酸乙酯萃取3 种方式处理样品。经甲醇超声和乙酸乙酯萃取，盐酸益母草碱的提取率较高，定量准确。甲醇超声提取更便捷，适用于院内制剂的快速检测，故选择甲醇超声处理。

3.3 色谱条件选择

前期研究中发现，产后康膏按照2015 年版《中国药典（一部）》中益母草的盐酸益母草碱高效液相色谱法测定含量，出现明显的干扰峰，色谱峰形存在明显拖尾，且分离度差。优化色谱条件，流动相为乙腈－0.2%磷酸溶液（22 ∶78，V／ V），检测波长为280 nm，流速为1.2 mL／min，柱温为20 ℃。结果表明，盐酸益母草碱的色谱峰分离度高，拖尾现象显著改善，且定量准确。

3.4 方法评价

产后康膏现有理化鉴别和检查项不足以对制剂进行质量控制。使用高效液相色谱法测定产后康膏中盐酸益母草碱的含量，具有较好的准确性和先进性，保证产后康膏质量的同时，提升其临床应用的安全性。该方法专属性强，准确度高，排除了干扰成分，且检测用时短，适用于院内制剂产后康膏的快速检测。