不同茶树品种吸收累积镉的差异研究

杨柳，陈钰佩，方丽，石元值*

（1.中国农业科学院茶叶研究所，农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

根据原国家环境保护部和国土资源部2014 年公布的《全国土壤污染状况调查公报》，我国耕地土壤质量不容乐观，耕地土壤点位超标率为19.4%，其中Cd点位超标率位居无机污染物首位[1]。随着环境重金属污染日趋加重，茶叶重金属污染问题不容忽视。茶树是我国重要的经济作物之一，截至2018 年，全国茶叶种植面积约为289.9万hm2，干毛茶总产量为264万t[2]，茶叶种植面积与产量位居世界第一。茶叶质量安全问题是影响茶产业可持续发展的重要因素。

近年来，茶叶重金属含量超标时有报道[3-5]，茶叶中的重金属污染主要来源于土壤污染[5-6]。目前茶园土壤重金属污染的研究主要基于野外调查采样和盆栽试验。野外调查结果显示，我国部分茶园出现了土壤重金属污染的情况，其中Cd 污染较为严重[7-15]。盆栽试验所开展的茶园土壤重金属污染研究主要以Pb为主[4-5，15]，对Cd 的研究较为匮乏，少部分涉及Cd 的研究主要关注Cd 对茶树生理指标、耐受性的影响以及茶园土壤Cd 有效性的变化[6，13，16-18]。如吕亚敏等[16]研究不同种类磷肥对茶园土壤中Cd 有效性的影响，发现土壤pH 与有效态Cd 呈正相关；刘东娜[17]基于水培试验研究茶树吸收累积Cd的特性，发现叶面施氮、根部施磷钾可抑制茶树吸收累积Cd，一定浓度的钙、铝离子可抑制茶树各器官对Cd的积累。目前茶树吸收累积Cd 的机理研究较少，也鲜见有关不同品种茶树吸收富集镉的差异比较。本研究从不同茶树品种着手，分析茶树各部位Cd 含量的变化、Cd 的富集转运系数以及Cd 相关转运蛋白的基因表达，了解不同品种茶树对Cd 的响应差异，为进一步揭示茶树吸收累积Cd 的机理奠定基础，旨在从源头控制茶树Cd 污染，保障茶叶质量安全。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取适制绿茶、红茶、乌龙茶的9个主栽茶树品种，以盆栽的方式种植于中国农业科学院茶叶研究所嵊州综合实验基地盆栽场，茶树的树龄均为四龄。9个茶树品种分别是：黄金芽、安吉白茶（白叶1号）、中茶108、乌牛早（嘉茗1号）、浙农117、福鼎大白茶、紫娟、丹桂、铁观音，供试品种基本特征及适制性如表1所示。

表1 供试品种基本特性及适制性Table 1 Basic information of the tested tea varieties

每盆盆栽含土20 kg，土壤基本理化性状：pH 4.19、有机质含量17.14 g·kg-1、总氮1.72 g·kg-1、有效磷56.3 mg·kg-1、速效钾167.7 mg·kg-1、Cd 含量0.142 mg·kg-1。每盆种植茶树3株，试验处理前一周对茶树进行等高度（40 cm）修剪，每盆施茶树专用肥2 g（N∶P2O5∶K2O=22∶8∶12）。设置两个处理：对照（CK）和Cd处理，其中Cd处理外源添加Cd（NO3）2溶液至土壤Cd含量为1 mg·kg-1，均设三次重复，共54盆。期间将土壤含水量保持在田间持水量的65%～70%，及时去除虫害、杂草，施肥，保证每盆茶树培养条件一致。

1.2 样品的制备及测定

茶树种植三个月后，按照新梢（一芽三叶）、成熟叶、枝干、根系四个部位分开取样，同时取茶树根际土壤。植物样品经自来水清洗三次，再用去离子水清洗三次，之后用滤纸吸干表面水分计鲜质量，用微波炉快速杀青后置于烘箱中80 ℃烘干至恒质量，称取并记录各部位干物质质量。植物样品用植物粉碎机粉碎后，装入密封袋保存待用。土壤样品摊放风干，除去砾石等杂质，磨碎过100目筛装入密封袋保存待用。

称取（0.200 0±0.001）g植物样品于聚四氟乙烯管中，加入4 mL HNO3和4 mL HF，放入微波消解仪（MARS6，美国CEM 公司），设定程序使植物样品在25 min 内升温至180 ℃，并在180 ℃保持20 min。冷却至室温于通风橱取出，赶酸仪150 ℃赶酸至仅剩1 mL 液体，用3%硝酸溶液（V/V）定容至50 mL 容量瓶中，50 mL离心管保存待测。称取（0.200 0±0.001）g土壤样品于聚四氟乙烯管中，加入6 mL HNO3、2 mL HCl和1 mL HF，放入微波消解仪，设定程序使土壤样品在30 min内升温至190 ℃，并在190 ℃保持30 min，其余步骤同上。使用高分辨电感耦合等离子体质谱仪（HR-ICP-MS，ELEMENTⅡ，美国热电）测量样品中Cd 含量。所用酸试剂均为色谱纯，塑料器皿及微波消解所用的聚四氟乙烯管使用之前均用10%硝酸溶液浸泡24 h，经自来水清洗三次，去离子水清洗三次后待干使用。

1.3 仪器工作条件

使用1 μg·L-1的Ba、B、Co、Fe、Ga、In、K、Li、Lu、Na、Rh、Sc、Tl、U、Y 调谐溶液对仪器条件进行最优化选择，使1 μg·L-1的Li 计数大于106cps。MoO/O≤0.2%，具体ICP-MS 工作参数：RF 功率1 245 W，冷却气流速15.99 L·min-1，辅助气流速0.99 L·min-1，载气流速0.971 L·min-1，采样深度-2.40 mm，采集时间20 s，扫描次数9次。

1.4 指标定义与计算公式

重金属富集系数（Bioconcentration factor，BCF）是指植物某一部位的重金属元素浓度与其所在土壤中同一种重金属元素浓度的比值，BCF＞1，说明植物具有较强富集能力。

重金属转移系数（Biological transfer factor，BTF）是指植物的地上部位中重金属浓度与地下部位相应重金属的浓度之比，BTF＞1，说明植物在体内运输重金属的能力较强[19]。

重金属累积量是指单位质量的干物质试样中所含重金属的质量，mg·kg-1。

重金属分布率是指茶树某部位的重金属累积量占整个茶树植株总累积量的百分比值[17]。

计算公式如下：

BCF=茶树体内某一部位重金属含量（mg·kg-1）/土壤中重金属含量（mg·kg-1）

BTF=茶树地上部位重金属含量（mg·kg-1）/地下部分重金属含量（mg·kg-1）

重金属累积量（mg·kg-1）=消解液中重金属浓度（mg·L-1）×消解液体积（mL）/干物质质量（g）

重金属分布率=茶树某部位的重金属累积量（mg·kg-1）/茶树植株的重金属总累积量（mg·kg-1）×100%

1.5 重金属污染评价标准

茶叶中重金属污染评价标准：《茶叶中铬、镉、汞、砷及氟化物限量》（NY 659—2003）。

土壤中重金属污染评价标准：《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）。

1.6 茶树根部总RNA提取与cDNA合成

取0.1 g 茶树根部冷冻样采用RNAprep pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（Tiangen，北京）进行总RNA 的提取，NanoDrop 2000 微量核酸蛋白测定仪测定所提取RNA 质量及浓度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 完整性。采用Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa，大连）将所提取的根部总RNA 反转录成cDNA，用于基因表达分析。

1.7 荧光定量PCR

以试验处理每个样品RNA 反转录成的cDNA 为模板，采用qRT-PCR 对不同茶树品种根部的镉转运蛋白进行表达分析。荧光定量qRT-PCR 特异引物见表2，内参基因为GAPDH。按照SYBR GreenⅠMaster（TaKaRa，大连）的操作说明来进行实时荧光定量PCR（Quantitative real time RT-PCR），反应体系为：SYBR GreenⅠMaster 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.1 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O 至终体积10 μL。Roche Light Cycler 480 作为qRT-PCR 的平台，反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，40 个循环；每个样品技术学重复2 次，结果采用2-ΔCt算法来计算。

表2 荧光定量PCR引物序列Table 2 Quantitative PCR primer sequences

1.8 数据处理

采用Excel 2013 进行数据处理，SigmaPlot 12.5 绘图，利用SAS 9.4统计分析软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）、α=0.05水平下的LSD检验。

2 结果与讨论

2.1 Cd对不同茶树品种地上部分干物质质量的影响

Cd 处理下的生物量大小是植物对重金属耐性大小的直接表现。不同品种茶树地上部分的干物质质量如图1 所示，在未添加Cd 的土壤上种植时，福鼎大白干物质质量最小，丹桂最大，其他品种之间差异不显著；在添加镉的土壤上种植时，与对照相比，大部分品种的干物质质量都不同程度地增加，其中安吉白茶干物质质量最小，浙农117 最大。研究表明低镉浓度可以促进植物的生长，刘志华等[20]发现低浓度Cd 对耐性强的大白菜品种的生长有促进作用；Zhi 等[21]发现低镉浓度能够促进大豆的生长；刘周莉等[22]发现低浓度Cd（2.5 mg·L-1）对忍冬的生长具有一定促进作用，表现出一定程度的毒物兴奋效应。

2.2 不同茶树品种各部位的镉含量差异

不同茶树品种各部位的镉含量与分布如图2 所示。从图2a 可知，对照处理、Cd 处理下茶树新梢Cd含量之间差异显著，Cd 处理下茶树新梢的Cd 含量显著高于对照，对照、Cd 处理下茶树新梢Cd 含量范围依次为0.010～0.085、0.013～0.094 mg·kg-1，平均值分别为0.033、0.044 mg·kg-1。《茶叶中铬、镉、汞、砷及氟化物限量》（NY 659—2003）规定茶叶中Cd≤1 mg·kg-1，因此两个处理中茶树新梢Cd含量远远低于标准限值。对照处理下，不同茶树品种的Cd 含量排序依次为浙农117＞紫鹃＞黄金芽＞丹桂＞福鼎大白＞安吉白茶＞中茶108＞铁观音＞乌牛早；对于Cd 处理而言，不同茶树品种的Cd 含量排序依次为浙农117＞紫鹃＞黄金芽＞铁观音＞安吉白茶＞丹桂＞福鼎大白＞中茶108＞乌牛早。两个处理下，浙农117 新梢中的Cd 含量都较高，乌牛早新梢中的Cd含量最少。

从图2b 可以看到，对照、Cd 处理下茶树成熟叶Cd 含量范围依次为0.079～0.110、0.092～0.133 mg·kg-1，平均值分别为0.090、0.112 mg·kg-1，Cd 处理下茶树成熟叶的Cd 含量显著高于对照。对照处理下，不同茶树品种成熟叶的Cd 含量排序依次为黄金芽＞安吉白茶＞紫鹃＞中茶108 ＞福鼎大白＞铁观音＞乌牛早＞浙农117＞丹桂；对于Cd处理而言，不同茶树品种成熟叶的Cd含量排序依次为黄金芽＞安吉白茶＞浙农117＞丹桂＞铁观音＞乌牛早＞福鼎大白＞紫鹃＞中茶108，其中黄金芽与安吉白茶、浙农117 差异不显著。两种处理下，成熟叶Cd含量最高的茶树品种都是黄金芽，而成熟叶Cd 含量最低的品种在对照、Cd 处理下分别为丹桂、中茶108。

图2c显示，对照、Cd处理下茶树枝干Cd含量范围依次为0.116～0.242、0.134～0.412 mg·kg-1，平均值分别为0.185、0.293 mg·kg-1。对照处理下，不同茶树品种枝干的Cd含量排序依次为黄金芽＞浙农117＞中茶108＞丹桂＞铁观音＞安吉白茶＞紫鹃＞乌牛早＞福鼎大白，其中黄金芽与浙农117差异不显著；Cd处理下，不同茶树品种枝干的Cd含量排序依次为黄金芽＞铁观音＞安吉白茶＞浙农117＞丹桂＞紫鹃＞中茶108＞乌牛早＞福鼎大白。

图2d 显示，对照、Cd 处理下茶树根部Cd 含量范围依次为0.814～1.88、19.26～42.88 mg·kg-1，平均值分别为1.44、32.79 mg·kg-1。可以看出，茶树体内镉含量最高的部位是根部，茶树各部位镉含量呈现出自下而上递减的规律。对照处理下，不同茶树品种根的Cd含量排序依次为浙农117＞丹桂＞黄金芽＞安吉白茶＞铁观音＞乌牛早＞中茶108＞紫鹃＞福鼎大白；Cd 处理下，不同茶树品种根部的Cd 含量排序依次为安吉白茶＞乌牛早＞铁观音＞紫鹃＞黄金芽＞丹桂＞福鼎大白＞中茶108＞浙农117。综上，Cd 处理下浙农117 新梢中Cd含量最高，而根部Cd含量最低。

图1 不同品种茶树地上部分干物质质量Figure 1 Dry weight in aboveground part of different tea plant varieties

图2 不同茶树品种各部位的Cd含量Figure 2 Content of Cd in different parts of tea plant varieties

2.3 不同茶树品种土壤的镉含量

从图3 可以看到，对照、Cd 处理下不同茶树品种土壤Cd含量范围依次为0.185～0.215、0.338～0.761 mg·kg-1，平均值分别为0.194、0.448 mg·kg-1。对照处理下，不同茶树品种土壤的Cd 含量排序依次为安吉白茶＞铁观音＞浙农117＞黄金芽＞福鼎大白＞丹桂＞乌牛早＞中茶108＞紫鹃；Cd 处理下，不同茶树品种根际土壤的Cd 含量排序依次为安吉白茶＞中茶108＞浙农117＞黄金芽＞福鼎大白＞乌牛早＞紫鹃＞丹桂＞铁观音。

《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）规定pH≤5.5时，Cd的农用地土壤污染风险筛选值为0.3 mg·kg-1，风险管制值为1.5 mg·kg-1。对照处理下，各个品种土壤Cd含量低于风险筛选值；Cd 处理下各个品种土壤Cd 含量介于风险筛选值与风险管控值之间，总体低于1 mg·kg-1，说明茶树在生长过程中会从土壤中吸收Cd运输到体内。

2.4 Cd在茶树-土壤系统的富集和转运

从图4a可以看到，对照、Cd处理下不同茶树品种根部对Cd 的富集系数范围为1.19～2.83、7.17～30.12，平均值分别为1.96、17.94，说明无论土壤是否被Cd污染，茶树根部对Cd 的富集能力均较强，Cd 处理下，茶树根部对Cd 的富集能力表现更强。对照处理下，不同茶树品种根部富集能力依次为丹桂＞黄金芽＞浙农117＞乌牛早＞安吉白茶＞铁观音＞中茶108＞紫鹃＞福鼎大白；Cd 处理下，不同茶树品种根部富集能力依次为铁观音＞丹桂＞紫鹃＞乌牛早＞黄金芽＞福鼎大白＞安吉白茶＞中茶108＞浙农117。

图4b显示对照、Cd处理下根-枝干的转运系数范围分别是0.413～0.760、0.017～0.078，平均值分别为0.55、0.041。对照处理的转运系数大于Cd处理，原因是对照处理下不同茶树品种根部Cd 含量较高，而枝干的Cd 含量较低，因此计算得出对照处理的转运系数较大。从图4b 可以看到，对照处理下不同茶树品种根-枝干的转运能力依次为中茶108＞紫鹃＞福鼎大白＞黄金芽＞铁观音＞乌牛早＞安吉白茶＞丹桂＞浙农117；Cd 处理下，不同茶树品种根-枝干的转运能力依次为浙农117＞中茶108＞黄金芽＞铁观音＞丹桂＞安吉白茶＞紫鹃＞福鼎大白＞乌牛早。

图4c显示对照、Cd处理下根-成熟叶的转运系数范围分别是0.043～0.105、0.002～0.007，平均值分别为0.066、0.004。对照处理下不同茶树品种根-成熟叶的转运能力依次为福鼎大白＞紫鹃＞中茶108＞乌牛早＞黄金芽＞安吉白茶＞铁观音＞浙农117＞丹桂；Cd 处理下不同茶树品种根-成熟叶的转运能力依次为浙农117＞中茶108＞黄金芽＞丹桂＞福鼎大白＞紫鹃＞安吉白茶＞乌牛早＞铁观音。

从图4d 可以看到，对照、Cd 处理下根-新梢的转运系数范围分别是0.006～0.073、0.000 3～0.006 1，平均值分别为0.024、0.002。对照处理下不同茶树品种根-新梢的转运能力依次为紫鹃＞浙农117＞福鼎大白＞黄金芽＞丹桂＞安吉白茶＞中茶108＞铁观音＞乌牛早；Cd 处理下不同茶树品种根-新梢的转运能力依次为浙农117＞紫鹃＞黄金芽＞中茶108＞福鼎大白＞丹桂＞铁观音＞安吉白茶＞乌牛早。

以上研究结果表明，Cd 在茶树体内的分布趋势表现为根＞枝干＞成熟叶＞新梢，茶树吸收Cd之后主要富集在根部，这与前人的研究结果相同[16-18]。

2.5 Cd 处理下不同茶树品种根部镉相关转运蛋白编码基因的表达

一般认为镉没有特异的转运蛋白，其通常借助锌、铁、钙、锰等二价阳离子的转运体系[23]，包括调控重金属向细胞内转运能力的主要基因：锌铁调控蛋白（Zinc-iron regulatory proteins，ZIP 家族）、黄色条纹样蛋白（Yellow stripe-like，YSL 家族）、天然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural-resistance-associated marophage protein，Nramp）等；调控重金属在细胞内储存能力的主要基因：ATP 结合盒（ABC）转运器（ATP-binding cassette transporter）、阳离子交换体（Cation exchange，CAX）和P1B型ATPases（P1Btype ATPase，HMA）[24-25]。

图3 不同茶树品种土壤的Cd含量Figure 3 Content of Cd in soil of tea plant varieties

图4 不同茶树品种对Cd的富集及新梢、成熟叶、枝干对Cd的转运Figure 4 Cd accumulation in roots and translocation to young leaves，mature leaves and branches in different tea plant varieties

茶树为叶用植物，生产中主要采食新梢部分。由以上研究结果可以得出，新梢中Cd 含量从高到低依次为浙农117＞紫鹃＞黄金芽＞铁观音＞安吉白茶＞丹桂＞福鼎大白＞中茶108＞乌牛早，因此挑选新梢Cd 含量最高的两个品种（浙农117 和紫鹃）和Cd 含量最低的两个品种（中茶108 和乌牛早）测定镉相关转运蛋白的基因表达。从浙农117、紫鹃、中茶108和乌牛早在不同部位的镉分布率（图5b）来看，镉主要分布在茶树的根部。因此，重点分析茶树根部镉相关转运蛋白编码基因的表达情况，测定的基因有CsZIP1、CsZIP2、CsHMA1、CsHMA2和CsCAX2。

图5 中茶108、乌牛早、浙农117和紫鹃镉的总累积量与分布率Figure 5 Cd total accumulation and distribution in Zhongcha108、Wuniuzao、Zhenong117 and Zijuan

图5a 为浙农117、紫鹃、中茶108 和乌牛早镉的总累积量，从中可以看出紫鹃与乌牛早镉的总累积量高于中茶108 和浙农117。图6 为Cd 处理下不同茶树品种根部镉相关转运蛋白编码基因的表达情况，由图6a、图6b 可知，CsZIP1、CsZIP2在紫鹃中表达量最高，图6c 中CsHMA1在这四个品种的表达无显著差异，从图6d、图6e 中可以看出CsHMA2和CsCAX2在紫鹃中表达量最高。由此可知，CsZIP1、CsZIP2、CsHMA2 和CsCAX2在茶树根部的表达量与品种间镉总累积量的差异相一致，推测CsZIP1、CsZIP2、CsHMA2和CsCAX2在茶树吸收累积镉的过程中起主要作用，但其相关机理需要进一步研究。

图6 Cd处理下不同茶树品种根部镉相关转运蛋白编码基因的表达情况Figure 6 Effect of Cd on gene expression of Cd transporter in different tea varieties

3 结论

（1）土壤外源添加Cd含量1 mg·kg-1处理下，各品种茶树新梢Cd 含量依次为浙农117＞紫鹃＞黄金芽＞铁观音＞安吉白茶＞丹桂＞福鼎大白＞中茶108＞乌牛早；成熟叶Cd 含量依次为黄金芽＞安吉白茶＞浙农117＞丹桂＞铁观音＞乌牛早＞福鼎大白＞紫鹃＞中茶108；枝干Cd 含量依次为黄金芽＞铁观音＞安吉白茶＞浙农117＞丹桂＞紫鹃＞中茶108＞乌牛早＞福鼎大白；根中Cd 含量依次为安吉白茶＞乌牛早＞铁观音＞紫鹃＞黄金芽＞丹桂＞福鼎大白＞中茶108＞浙农117。综上，Cd 处理下，浙农117 新梢中Cd 含量最高，而根部Cd含量最低。

（2）不同Cd 处理对茶树各部分Cd 含量影响不同，对照处理下，不同品种茶树新梢、成熟叶、枝干、根的平均Cd含量为0.033、0.090、0.185、1.44 mg·kg-1，显著低于这四个部位Cd 处理下的平均Cd 含量0.044、0.112、0.293、32.79 mg·kg-1。可以看出，茶树体内镉含量最高的部位是根部，茶树各部位镉含量呈现出自下而上递减的规律。

（3）本研究中9 种茶树品种新梢的Cd 含量都远低于国家标准限值（Cd≤1 mg·kg-1），说明当茶园土壤Cd 含量介于风险筛选值（0.3 mg·kg-1）与风险管控值（1.5 mg·kg-1）之间时，茶叶是可以放心采摘的。

（4）从茶树根部镉相关转运蛋白编码基因的表达情况来看，推测CsZIP1、CsZIP2、CsHMA2和CsCAX2在茶树吸收累积镉的过程中起主要作用，但其相关机理需要进一步研究。