翎电鳗卵巢发育组织学研究

哈承旭，杨翠华，王 玮，王云忠，刘 萍

( 1.青岛海洋科技馆，山东 青岛 266003； 2.中国水产科学研究院 黄海水产研究所， 山东 青岛 266071 )

翎电鳗(Apteronotusalbifrons)，俗称黑魔鬼鱼、黑羽毛，属裸背鳗目、翎电鳗科[1]，原产于南美洲的巴西及亚马逊河流域。翎电鳗性格温和，游姿轻盈美妙，是深受广大水族爱好者喜爱的热带观赏鱼。翎电鳗对人工繁殖的饲养条件要求极为苛刻，目前我国翎电鳗的繁殖技术还不够成熟，大多需要依赖进口以满足市场需求。

现存的25 000多种鱼类中，作为观赏鱼的种类有3200多种。目前对观赏鱼类的种质资源分布、养殖技术、遗传结构分析、人工繁育、病害防治等研究均已全面展开。然而作为水族馆展示的重要品种，国内外尚未见有关翎电鳗生物学研究的报道。笔者对人工养殖条件下翎电鳗卵巢的发育进行形态学和组织学观察，旨在了解该鱼的卵巢发育规律及特点，为今后翎电鳗人工繁育奠定基础，同时完善该鱼的生物学资料，填补国内外水产种质资源空白。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

2019年1月购买3月龄翎电鳗，总计202尾。

饲养于2.0 m×0.6 m×0.6 m水族箱内。饲养水温(28±0.5) ℃，pH 7.5±0.5，光照时长16 h∶8 h(光照∶黑暗)。每日投喂线虫及红虫各1次，每日按时清饵排污，日换水率5%。

1.2 样本的数量特征测量与性腺形态观察

取3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月龄雌性个体各10尾，测量体质量(m)、全长(LO)、体长(LB)、体高(hB)、性腺质量(mG)，进行性腺的形态学观察并拍照。取性腺于波恩氏液中固定，固定时间24 h，后转移至70%乙醇中保存。性腺指数(wGSI)按下式计算：

wGSI/%=mG/m×100%

1.3 组织切片的制作和观察

采用常规石蜡组织切片方法，苏木精—伊红染色。在显微镜(Olympus BX53)下观察、拍照。

1.4 数据分析和处理

采用Excel 2010进行数据分析，测量数据及性腺指数均使用平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件对以上数值进行单因素方差分析，检测变化差异的显著性。取差异显著性水平为0.05，P≤0.05视为差异显著，反之差异不显著。

2 结果与分析

2.1 卵巢的基本形态

翎电鳗的卵巢分为左、右两叶，位于体腔的腹中线，紧贴于肾脏腹面两侧，卵巢发育成熟后呈囊状。卵巢前端具有一段较短的生殖道，经泄殖孔通向体外，泄殖孔位于体前端、下颌后方(图1)。

图1 翎电鳗卵巢发育各期外观结构Fig.1 Appearance and structure of ovary in different developmental stages of apteronotid eel A. albifronsa.Ⅰ期卵巢； b.Ⅱ期卵巢； c.Ⅲ期卵巢； d.Ⅳ期卵巢； e.Ⅴ期卵巢； f.Ⅵ期卵巢.a.ovary in stage Ⅰ; b.ovary in stage Ⅱ; c.ovary in stage Ⅲ; d.ovary in stage Ⅳ; e.ovary in stage Ⅴ; f.ovary in stage Ⅵ.

2.2 卵母细胞发育分期的组织学特征

Ⅰ时相：卵原细胞进行多次有丝分裂，之后向初级卵母细胞转变。此阶段细胞体积小，细胞质少，细胞核大，呈椭圆形，核内细丝状的染色质成网状结构，特点为细胞核较大，细胞界限不明显(图2a)。

Ⅱ时相：初级卵母细胞小生长期阶段，呈圆形、椭圆形或多角形，细胞核和细胞质增加，细胞增大，多个细胞核分散排列，略近中央，核膜明显，核质着色浅，早期核中可见极细棒状染色体。核仁多个，分布于核膜内缘。滤泡细胞在卵母细胞外先是形成稀疏的滤泡膜，之后随着滤泡细胞的增多，滤泡膜逐渐完整(图2b)。

Ⅲ时相：初级卵母细胞体积增长显著，由小生长期进入大生长期。其形态细胞基本呈圆球形，细胞体积明显增大，细胞质呈现弱嗜碱性。在质膜的外侧，滤泡膜由单层增为双层，在滤泡膜和卵细胞膜之间形成放射膜。核膜呈波状形，十几个到数十个不等的细小核仁附在核膜上，一般未见粗大核仁存在。出现卵黄颗粒及卵黄斑。细胞质内靠近细胞膜处出现液泡，液泡随着卵细胞的生长不断发育，数目增加(图2c～e)。

Ⅳ时相：初级卵母细胞进入发育鼎盛期即卵黄充满期。细胞及细胞核直径均有所增大。细胞核被卵黄挤到周围以及细胞膜边缘；核膜形状不规则。卵黄球逐渐增多，直至几乎充满核外空间。只有在核周围及靠近卵膜边缘有较多的细胞质，呈弱嗜碱性。滤泡膜和放射膜变得更加明显，放射带上的条纹清晰可见。胞外膜可见滤泡细胞构成的颗粒细胞层(图2f～g)。

Ⅴ时相：初级卵母细胞减数分裂为次级卵母细胞，核膜溶解，细胞核变形，细胞质中的卵黄颗粒逐渐融合成块状，呈均质红染。成熟卵母细胞脱离滤泡膜，进入卵巢腔，成为游离卵(图2h～i)。

2.3 卵巢的发育分期

参考文献[2-4]的卵巢分期标准，将翎电鳗的卵巢分为6个时期，各期主要特征如下：

Ⅰ期卵巢：呈淡肉色、透明线状，血管较少，外观无法分辨雌雄。性腺中主要以卵原细胞为主(图1a)。

图2 翎电鳗的卵巢及卵母细胞发育Fig.2 Development of ovarian and oocytes of apteronotid eel A. albifronsa.4月龄雌鱼卵巢横切，示Ⅱ期卵巢； b.第Ⅱ时相卵母细胞； c.6月龄雌鱼卵巢横切； d.8月龄雌鱼卵巢横切，示Ⅲ期卵巢； e.第Ⅲ时相卵母细胞； f.10月龄雌鱼卵巢横切，示Ⅳ期卵巢早期； g.第Ⅳ时相卵母细胞； h.产卵后雌鱼卵巢横切，示萎缩的卵巢； i.产卵后留下的空滤泡； Ⅰ.第Ⅰ时相卵母细胞； Ⅱ.第Ⅱ时相卵母细胞； Ⅲ.第Ⅲ时相卵母细胞； Ⅳ.第Ⅳ时相卵母细胞； Og.卵原细胞； SP.产卵板； N.细胞核； Nu.核仁； CY.细胞质； NM.核膜； FC.滤泡细胞； Va.液泡； YG.卵黄颗粒； G.颗粒细胞； PM.细胞质膜； ZR.放射膜； EF.空滤泡a.transverse section of ovary of 4-month-old fish, ovary in stage Ⅱ; b.oocyte in phase Ⅱ; c.transverse section of ovary of 6-month-old fish; d. transverse section of ovary of 8-month-old fish, ovary in stage Ⅲ; e.oocyte in phase Ⅲ; f.transverse section of ovary of 10-month-old fish, ovary in early stage Ⅳ; g.oocyte in phase Ⅳ; h.transection of ovary after spawning, atrophied ovary; i.empty follicles remains after spawning； Ⅰ.oocyte in phase Ⅰ； Ⅱ.oocyte in phase Ⅱ； Ⅲ.oocyte in phase Ⅲ； Ⅳ.oocyte in phase Ⅳ； Og.oogonium； SP.spawning plate； N.nucleus； Nu.nucleus； CY.cytoplasm； NM.nuclear membrane； FC.follicle cell； Va.vacuoles； YG.yolk globules； G.granule cell； PM.plasma membrane； ZR.zone radiate； EF.empty follicle.

Ⅱ期卵巢：呈肉红色，卵巢加粗，仍有透明质感，雌雄亦不易分辨，卵巢表面及组织内部密布微血管，卵巢中较多Ⅱ时相初级卵母细胞，仍有少量卵原细胞(图1b、图2a)。

Ⅲ期卵巢：呈淡黄色，为膨胀的长囊状，肉眼可见卵粒，但不能分离。组织学观察发现，此时主要为Ⅲ时相的初级卵母细胞，少量的Ⅱ时相初级卵母细胞，后期出现少量Ⅳ时相卵母细胞(图1c、图2d)。

Ⅳ期卵巢：呈鲜黄色，膨胀厚实，肉眼可见黄色卵粒充满整个卵巢。血管发达，变粗，在卵巢膜上呈网状分布。卵巢中同时含卵原细胞、第Ⅱ时相、第Ⅲ时相和第Ⅳ时相卵母细胞，以第Ⅳ时相卵母细胞为主(图1d、图2f)。

Ⅴ期卵巢：呈橙黄色，体积达到最大，卵巢中主要为第Ⅴ时相卵母细胞，第Ⅱ时相、第Ⅲ时相及第Ⅳ时相卵母细胞含量较少，卵巢壁变薄，滤泡膜破裂，卵母细胞释放到腹腔，卵子成熟(图1e、图2g)。

Ⅵ期卵巢：体呈暗红色，体积较Ⅴ期卵巢缩小。卵巢中含少量卵原细胞、第Ⅱ时相、第Ⅲ时相初级卵母细胞以及卵子排出后留下的空滤泡(图1f、图2i)。

2.4 翎电鳗卵巢发育过程中生物学数据的变化

翎电鳗性腺发育情况与月龄的关系见表1。4月龄雌鱼卵巢中仍含有较多的卵原细胞，发育至Ⅱ期；8月龄雌鱼的卵巢中含有卵原细胞、第Ⅱ时相和第Ⅲ时相卵母细胞，发育至第Ⅲ期；10月龄雌鱼的卵巢则同时存在卵原细胞、第Ⅱ时相、第Ⅲ时相和第Ⅳ时相卵母细胞，发育至第Ⅳ期，达性成熟；11月龄雌鱼卵巢中第Ⅴ时相卵母细胞占主要成分，为Ⅴ期卵巢。测量得Ⅴ期卵巢中成熟卵径的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm内。

翎电鳗雌鱼性腺指数的变化见图3。随着翎电鳗性腺开始发育卵巢质量增加，亲鱼性腺指数开始升高，Ⅲ期时发育加速，在产卵期(卵巢Ⅴ期)时达到顶峰，为(17.9±1.3)%，显著高于卵巢Ⅲ期时的(4.30±0.35)%。

表1 翎电鳗性腺发育与月龄的关系Tab.1 Relationship between ovarian development and months of age in apteronotid eel A. albifrons

图3 翎电鳗雌鱼性腺指数的月变化Fig.3 Monthly variations in GSI of female apteronotid eel A. albifrons

3 讨 论

3.1 翎电鳗的卵巢发育特点

翎电鳗腹膜形成的卵巢囊包围在卵巢周围，卵巢在体腔前端相遇，形成与泄殖孔相连的输卵管，为封闭卵巢。研究发现，翎电鳗卵母细胞发育至第Ⅱ时相晚期时形成单层滤泡膜，在第Ⅲ时相卵母细胞中滤泡膜经分化成为内、外两层，外层为鞘膜细胞层，内层为颗粒细胞层，这与鲇鱼(Silurusasotus)[5]的滤泡发育过程相似。在翎电鳗的卵黄发生过程中，卵黄物质有液泡(又被称为卵黄泡)和卵黄颗粒两种类型。第Ⅲ时相卵母细胞内首先在胞质较外侧出现液泡，由一个发展成为一层，再逐步由胞质外侧向胞质中央不断扩展；卵黄颗粒晚于液泡出现，逐渐融合增大成为球状和板状卵黄，长薄鳅(Leptobotiaelongate)[6]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[7]等的卵黄发育过程与此相同。此外还发现，第Ⅲ时相卵母细胞开始出现放射膜，后期伴随着翎电鳗卵母细胞的发育，由于微绒毛相互从卵膜上缩回，导致放射膜厚度逐渐减小，在国内外不少专家学者的研究中发现了此类现象[8]，如东海鳓鱼(Ilishaelongata)[9]，甚至有些鱼类在卵母细胞成熟过程中放射带会基本消失，如东海银鲳(Pampusargenteus)[10]。

3.2 翎电鳗的产卵类型分析

根据卵母细胞的发育情况，大多数硬骨鱼类的卵巢发育模式可分为同步型和非同步型，同步型产卵模式又分为完全同步型和分批同步型2种类型[11-12]。完全同步型，卵巢内的卵母细胞都处于同一发育时期，通常一生只产卵一次就死亡，如大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)[13]、黄尾密鲴(Xenocyprisdavidi)[14]。分批同步型，卵巢内存在两种或两种以上的卵母细胞类型，通常每年只产卵一次，如黄海高眼鲽(Cleisthenesherzensteini)[15]、圆斑星鲽(Veraspervariegates)[16]、美洲鲥(Alosasapidissima)[17]和双须骨舌鱼(Osteoglossumbicirrhosum)[18]等。分批非同步型，卵巢内存在各种时相的卵母细胞类型，通常一年内产卵多次，如斑马鱼(Daniorerio)[19]、青鳉(Oryziaslatipes)[20]、七彩神仙鱼(Symphysodonsp.)[21]等。观察显示，翎电鳗在形成多个Ⅳ时相卵母细胞的同时仍保持有Ⅲ时相和Ⅱ时相卵母细胞,也保留了一定数目的卵原细胞，各时相的细胞都占有一定的比例。Ⅴ期卵巢中成熟卵径的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm内，呈现出明显的分批产卵特征。即当翎电鳗亲鱼在营养积累充足且养殖环境理想的状态下，短时间内存在一批卵排出后新一批次的卵成熟并被释放的可能，因此翎电鳗卵巢发育规律应判定为分批同步型。鱼类的分批产卵主要是卵巢发育的不同步造成的，自然界中，分批产卵鱼对环境的适应能力更好，子代不会因为一次突发性的环境灾难就全军覆没；然而在生产环节，鱼类的分批产卵属性会对卵的收集增加一定难度，为人工繁殖制造了障碍。

3.3 翎电鳗的性腺发育指数

本试验中，翎电鳗达性成熟时，雌鱼平均性腺指数为17.9%。多数同步型卵巢发育模式性腺指数比非同步型性腺指数要高，美洲鲥鱼雌鱼成熟性腺指数为18.47%[17]，黄尾密鲴雌鱼性成熟的性腺指数为18.6%[14]。而分批非同步产卵类型的七彩神仙鱼达性成熟时雌鱼的平均性腺指数仅为0.712%[21]。

鱼类的性腺发育受到自身激素水平的调节，此外环境因子也对鱼类的生殖活动产生影响[22]。诸多环境因子如气象水文因子(水温、光照)、水体理化因子(盐度、pH)、饵料及产卵基质等均能对鱼类的生殖过程产生影响[23-24]。Bonnet等[25]发现，在产卵时改变光照周期会阻碍虹鳟卵母细胞发育，显著降低卵子的质量。人工饲养条件下，因饵料充沛且水质条件较好，翎电鳗性腺发育的速度较快，但翎电鳗产卵时对环境因子要求极高，当受到环境胁迫或成熟的卵子未能成功排出时，肉眼明显可见解剖后卵巢有褐色闭锁卵母细胞。目前，人工养殖下翎电鳗繁殖率较低，如何改善影响其性成熟及顺利排卵的环境因子是目前研究的主要内容。

4 结 论

通过常规石蜡切片方法对人工饲养条件下雌性翎电鳗卵巢的发育情况进行分析，根据其外部形态并结合切片显微观察，将翎电鳗卵巢发育分为6个时期，卵子发育分为5个时相。随着翎电鳗性腺开始发育卵巢逐渐增大，Ⅲ期时发育加速，在产卵期(卵巢Ⅴ期)时达到顶峰，显著高于发育前水平。翎电鳗卵巢在发育形成多个Ⅳ时相卵母细胞的同时仍保持有Ⅲ时相和Ⅱ时相卵母细胞，也保留了一定数目的卵原细胞，各时相的细胞都占有一定的比例。翎电鳗Ⅴ期卵巢中成熟卵径的大小分布于两个区间，卵巢发育规律为分批同步型。