miR-155与AGTR1在子痫前期患者胎盘组织中的表达

许 晨 孙丽君 柴市平 张文琦 姚春凤 杨 蕾 杨静宜

华北理工大学 河北唐山 063210；①唐山市妇幼保健院

妊娠期高血压疾病是造成孕产妇和新生儿死亡率升高的主要原因[1]，严重威胁妊娠期女性生命。目前子痫前期(PE)的发病机制尚未明确，推测为胎盘血管化障碍导致肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活而引发高血压表现。微小RNA(miRNA)是一种参与细胞增殖、血管生成和各种器官发育等的小分子非编码单链RNA，近年来发现其可影响子痫前期发病，且可能存在众多miRNA参与其中的代谢、免疫和相关信号通路调节[2]。现已证明，通过miR-155-CYR61-VEGF途径可以干扰滋养层迁移而抑制胎盘血管生成，导致PE发病[3]；miR-155也参与调控脐静脉内皮细胞因子的表达和血管舒张调节，抑制miR-155可改善内皮功能障碍[4]。血管紧张素Ⅱ受体1(AGTR1)是血管紧张素受体家族成员之一，它使血管紧张素在心血管系统中发挥作用，维持血压及循环血量变化。有研究表明，AGTR1基因突变可能导致肺动脉高压及PE[5-6]。AGTR1基因是miR-155的靶基因之一，且二者可能均参与PE的病理进展，故推测 miR-155通过调控AGTR1的表达影响PE病理过程。本研究比较病情程度不同的PE患者胎盘组织中的miR-155及AGTR1表达，研究PE发病过程中的分子机制，为及早发现和提供治疗PE拓展新方式。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年11月～2020年7月在唐山市妇幼保健院及唐山工人医院行剖宫产术分娩的65例孕产妇，无原发病及其他妊娠合并症。以妇产科学第9版为标准，分为正常孕产妇(对照组)29例、子痫前期组(PE组)15例、重度子痫前期组(重度PE组)21例。三组孕产妇体质量差异无统计学意义，年龄、孕周、收缩压及舒张压差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。本研究通过医院伦理委员会讨论并已获得批准，患者知情并签署同意书。

表1 各组患者临床特征比较

1.2标本收集 取剖宫产术中娩出的胎盘，脱离母体后1min内，于母体面近脐带处，切割数块大小约1cm3的胎盘组织，避开钙化灶，用生理盐水漂洗3次去除血液，纱布吸干后放入冻存管中保存于-80℃冰箱。全程保持无菌条件。

1.3主要试剂 兔抗人AGTR1多克隆抗体(ab124505，Abcom公司)，GAPDH抗体(ab-9482，Abcom公司)，山羊抗兔二抗(zb-2301，中杉金桥)，超纯RNA提取试剂(TaKaRa Code D9108B)，反转录试剂盒(TaKaRa Code DRRO47A)，SYBR Green realtime PCR Master Mix(QPK-201，TOYOBO公司)，5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Code DRR120A)。

1.4实验方法

1.4.1实时定量PCR法检测胎盘中miR-155的表达 使用超纯RNA提取试剂，对胎盘组织中的总RNA进行充分提取并测定浓度及纯度，电泳实验检测完整性；使用反转录试剂盒将miRNA 逆转录合成cDNA；SYBR Green realtime PCR Master Mix试剂盒及荧光定量 PCR仪对 miRNA的cDNA进行 PCR扩增，将目的基因引物和 U6内参基因引物进行扩增，并于60℃～95℃进行溶解曲线分析。miR-155上游引物序列为5'- GCCGAGTTAATGCTAATCGTG-3'，内参基因引物U6上游引物序列为5'- CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。通过2-△△CT相对定量公式计算各组胎盘组织中的miR-155表达量。

1.4.2Western blotting法检测胎盘中AGTR1的表达 对各组胎盘组织中的总蛋白进行提取，应用考马斯亮蓝测定蛋白量，以GAPDH为内参，水浴使蛋白质变性，进行电泳、转膜，用封闭液封闭；将封闭后的膜放入一抗(兔抗人AGTR1多克隆抗体，浓度1：1000；GAPDH兔抗，浓度1：1000)中4℃过夜；二抗(山羊抗兔二抗，浓度1：10000)进行孵育，在凝胶成像分析系统中显影，目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值之比为各组胎盘组织中的AGTR1蛋白表达量。

2 结果

2.1各组胎盘组织中miR-155表达情况 实时定量PCR测定的miR-155扩增曲线为S型，扩增产物的溶解产物为单峰状，说明其为单一、特异性高且无污染的扩增产物，见图1。通过2-△△CT公式计算数据，对照组、PE组及重度PE组患者胎盘组织中miR-155的表达量分别为(1.18±0.12)、(1.57±0.07)、(1.98±0.10)，miR-155在PE组及重度PE组中的相对表达量较对照组升高，差异有统计学意义(F=384.2，P=0.000)。见表2。

图1 A.miR-155扩增曲线 B.U6内参扩增曲线 C.miR-155溶解曲线 D.U6内参溶解曲线

表2 各组患者胎盘组织中miR-155、AGTR1蛋白表达量及相关性

2.2各组胎盘组织AGTR1蛋白表达情况 通过Western blotting法得到各组条带，进行灰度分析，发现对照组、PE组及重度PE组AGTR1蛋白吸光度逐渐下降，其表达量分别为(0.86±0.08)、(0.57±0.04)、(0.29±0.07)，呈逐渐下降，差异有统计学意义(F=99.4，P=0.000)；对照组与PE组间、PE组与重度PE组间差异均有统计学意义(P<0.05)，即AGTR1蛋白的表达量随着病情程度加重而下降。见图2、表2。

2.3胎盘中miR-155与AGTR1表达的相关性 应用Pearson法分析miR-155与AGTR1的相关性，得出其相关系数为r=-0.954，即二者呈负相关，miR-155表达增加时AGTR1的表达下降。见表2。

图2 各组胎盘组织中

3 讨论

PE是临床常见的妊娠期高血压疾病，其发病机制尚未明确[7]。正常妊娠时，母胎间血液循环的建立需要胎盘通过血管生成和母体螺旋动脉重塑达到充分血管化，这一过程需要促血管生成因子和抗血管生成因子的相互协调，若两种因子的表达失衡则可能导致异常胎盘血管生成和疾病发生[8]。若子宫螺旋动脉滋养细胞无法正常重铸，胎盘灌注减少而释放胎盘因子引起全身炎症反应、内皮损伤及进一步的血管化障碍，导致RAAS系统激活，引发高血压疾病的表现。因此，胎盘是造成PE疾病演变的重要原因之一[9]。

miRNA作为关键的转录后调节产物参与降解基因和抑制翻译过程，影响细胞增殖、血管生成及各种器官发育。胎盘可表达大量miRNA，主要源于19号及14号染色体[10]，在胎盘发育的不同阶段存在时间或组织特异性。PE的病理过程中，不同miRNA参与代谢、转录、免疫、粘附和相关信号通路等的调节[11]。PE患者的细胞凋亡增强、异常免疫应答和血管生成与miR-182和miR-210的过表达密切相关[12]。与心脑血管疾病相关的miR-499a-5p表达上调已在PE和胎儿宫内生长受限(IUGR)患者的胎盘中发现，而miR-26a-5p、miR-103a-3p和miR-145-5p的表达下调也在早发型PE和IUGR中发现[13]。PE胎盘中几种过表达的miRNA，如miR-20b[14]、miR-16[15]和miR-675[16]等，通过抑制血管生成及滋养层的增殖和侵袭导致妊娠期高血压疾病的发病。有研究表明，miR-155是影响内皮细胞因子表达和血管舒张的重要因子，若被抑制则可改善内皮功能障碍[17]。miR-155在PE患者的胎盘中高表达，表明其可能参与病理进展过程。本研究结果显示随PE病情程度的加重miR-155在胎盘中表达水平逐渐上升。

AGTR1是血管紧张素受体家族成员之一，通过调节醛固酮的分泌作为控制血压及循环血量的重要效应器。AGTR1主要通过血管紧张素调控心血管系统，而血管紧张素Ⅱ(Ang II)可以通过诱发内皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞产生轻度炎症反应，在PE的发病机制中发挥重要作用。有研究推测，AGTR1基因突变可能导致原发性高血压、肺动脉高压及PE等的发病[18-19]。AGTR1基因是miR-155调控的靶基因之一，同时通过检索可以发现胎盘组织中的AGTR1基因表达显著高于其他脏器组织。本研究通过Western blotting检测发现，AGTR1在PE患者胎盘组织中呈低表达，且表达程度随病情程度加重而明显下降。

综上所述，PE组及重度PE组患者胎盘组织中的miR-155较对照组表达均升高，且重度PE组高于PE组；AGTR1蛋白的表达随病情加重而下降，即miR-155和AGTR1为负相关。据此推测，AGTR1蛋白在维持胎盘正常功能中可能发挥重要功能，miR-155可能通过调控AGTR1的表达而影响PE发病。后续将通过进一步实验深入研究miR-155与AGTR1在细胞层次的关联变化，明确二者在疾病进展中的作用，使其能够应用于疾病的预防与早期诊疗，从而改善母婴结局。