四氢姜黄素对脓毒血症小鼠心肌损伤的保护作用及其机制

王 伟,曾广伟,廉 诚,刘 慧,张晓东,安慧仙,高 钊,方 东,张艳涛,樊贝贝,孙梦娜,李 炜*

(1 西安国际医学中心医院心脏内科,西安 710100;2 空军军医大学第二附属医院心内科;*通讯作者,E-mail:liweiafmu@126.com)

脓毒血症是临床上常见的危重病症之一,其主要特征是血液微生物感染机体后分泌大量内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的全身炎症反应综合征,如未经有效治疗可进展为多器官功能衰竭,直至患者感染性休克死亡[1]。近年来内毒素对心脏的损害作用引起了广泛关注,心肌损伤及心脏功能障碍在脓毒血症早期即已存在,并且显著增加患者的死亡率[2,3]。目前尚无特异性的心脏保护药物改善脓毒血症的心脏并发症,因此,深入探究脓毒血症心肌损伤机制并制定有效的防治措施是临床上亟待解决的关键问题。

四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin,THC)是由姜科植物姜黄根茎中分离出的姜黄素在体内的主要代谢产物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[4]。以往有研究表明,THC在减轻多柔比星心脏毒性、心肌细胞缺血/再灌注损伤、病理性心肌肥厚和动脉粥样硬化等心血管疾病中均发挥了积极作用[5-8]。然而,THC能否抑制LPS诱导的小鼠脓毒症心肌损伤尚未见相关报道,并且THC减轻脓毒血症小鼠心肌损伤的分子机制也有待进一步探究。近年来发现,一种心脑血管疾病的明星保护分子SIRT1参与了脓毒血症心肌损伤发生过程中炎症、氧化应激和能量代谢等多种病理生理改变[9]。因此,本研究拟通过腹腔注射LPS法构建小鼠脓毒血症心肌损伤模型,旨在探讨THC对脓毒血症心肌损伤的保护作用并阐明其分子机制是否通过激活SIRT1信号通路实现。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为以下4组(每组10只):对照(control)组、LPS组、LPS+THC组及EX527+LPS+THC组。通过1次腹腔注射LPS(10 mg/kg,溶于生理盐水)建立脓毒血症小鼠心肌损伤模型[10];control组小鼠腹腔注射同等体积的生理盐水。control组和LPS组小鼠每日给予等量生理盐水灌胃处理一次;在LPS注射前7 d,LPS+THC组及EX527+LPS+THC组小鼠每日给予THC[100 mg/(kg·d)]灌胃一次共7 d,EX527+LPS+THC组小鼠在药物灌胃处理的同时给予5 mg/kg的EX527腹腔注射处理一次。

1.2.2 心脏功能检测 待实验完成后,异氟烷麻醉小鼠并将其置于恒温检测平板上,用VisualSonics Vevo 770系统和30 MHz超声探头进行超声心动检测,通过Vevo分析软件计算左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 心肌损伤特异性标志物测定 待实验完成后,处死小鼠,腹主动脉取血并静置、离心分离血清,采用酶学速率法测定CK、CK-MB和TnI,根据吸光度值计算出各酶的活性。

1.2.4 心肌组织SOD活性和MDA含量测定 待实验完成后,迅速摘下小鼠心脏,并用生理盐水制备成组织匀浆。严格按照试剂盒说明书测定心肌组织中氧化应激标记物SOD活性和MDA的含量。

1.2.5 心肌组织IL-1β和TNF-α表达水平测定 按1.2.3步骤用生理盐水制备小鼠心脏组织匀浆,严格按照ELISA试剂盒说明书检测心肌组织中IL-1β和TNF-α的表达水平。

1.2.6 心肌组织DHE染色 待实验完成后,迅速摘下小鼠心脏冻于液氮中,并制成5 μm厚度的冰冻切片。严格按照试剂盒说明书对组织切片进行DHE染色,用Olympus激光共聚焦显微镜拍摄照片,并使用Image-Pro Plus软件测定其中的乙锭荧光来比较各组小鼠心肌组织内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成量。

1.2.7 心肌组织中性粒细胞染色 待实验完成后,迅速摘下小鼠心脏用4%多聚甲醛固定并制成石蜡切片,将制备好的心脏石蜡切片经脱蜡复水和PBS液洗涤后,孵育于MPO单克隆抗体中4 ℃过夜,以MPO表达阳性表示中性粒细胞在各组心肌组织中的浸润情况。

1.2.8 心肌组织TUNEL染色 将1.2.6中制备好的心脏石蜡切片经脱蜡、复水、蛋白酶K溶液打孔操作后,按照TUNEL试剂盒说明书进行染色,并用激光共聚焦显微镜拍照并使用Image-Pro Plus软件分析。心肌细胞凋亡率=TUNEL染色阳性心肌细胞数目/心肌细胞总数×100%。

开天辟地、敢为人先的首创精神反映的是早期共产党人在探索救国救民道路中敢为人先、敢于创新的精神状态，彰显了共产党人走在时代前列的责任担当。李大钊是中国传播马克思主义的第一人，为宣传马克思主义及筹建中国共产党做出了卓越贡献；陈独秀在上海创建了中国共产党第一个组织，为中国共产党的正式成立奠定了组织基础；陈望道首译《共产党宣言》，成为传播马克思主义经典之作的代表；毛泽东开辟了农村包围城市、武装夺取政权的革命道路，成为马克思主义中国化的开拓者。

1.2.9 Western blot检测SIRT1、Ac-foxo1和gp91phox蛋白表达 各组小鼠心肌组织经裂解、离心、加上样缓冲液、煮沸等操作后,得到蛋白样本,并通过电泳、转膜、封闭等步骤后于4 ℃下用抗SIRT1(1 ∶1 000)、Ac-foxo1(1 ∶500)、gp91phox(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)的抗体孵育过夜。继而在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗中(1 ∶1 000)室温孵育1 h。使用Bio-Rad显像系统检测蛋白条带并用Image Lab软件进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠心肌损伤标志物比较

LPS注射后6 h检测小鼠心肌损伤特异性标志物活性显示,与control组相比,LPS组小鼠的血清CK、CK-MB和TnI活性均显著升高(P<0.01);给予THC处理后,与LPS组相比,LPS+THC组小鼠的血清CK、CK-MB和TnI活性均显著减低(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症心肌损伤的保护作用则被明显逆转(P<0.01,见表1)。

表2 小鼠血清中CK、CK-MB和TnI水平比较

2.2 各组小鼠心脏功能相关指标比较

LPS注射6 h后检测小鼠心脏功能指标显示,与control组相比,LPS组小鼠的LVEF和LVFS均显著降低(P<0.01);与LPS组相比,给予THC处理后,LPS+THC组小鼠的LVEF和LVFS值均显著升高(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症心脏功能的保护作用则被明显逆转(P<0.01,见图1)。

2.3 各组小鼠心肌组织氧化应激损伤相关指标比较

LPS注射6 h后检测小鼠心肌组织氧化应激相关指标显示,与control组相比,LPS组小鼠心肌组织中SOD的水平显著降低,脂质过氧化指标MDA的含量显著升高,gp91phox的蛋白表达明显增加(P<0.01),且ROS的生成量也显著上升;与LPS组相比,给予THC处理后,LPS+THC组小鼠心肌组织中SOD水平显著增加,MDA含量显著降低,gp91phox的蛋白表达明显下降,且ROS的生成也被显著抑制(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症小鼠心肌组织氧化应激损伤的保护作用则被明显逆转(P<0.01,见图2)。

与control组相比,##P <0.01;与LPS组相比,* * P <0.01;与LPS+THC组相比,&&P <0.01图1 各组小鼠心脏功能相关指标比较Figure 1 Comparison of myocardial function between groups

与control组相比,##P <0.01;与LPS组相比,* * P <0.01;与LPS+THC组相比,&&P <0.01图2 各组小鼠心肌氧化应激水平比较Figure 2 Comparison of myocardial oxidative stress indexes between groups

2.4 各组小鼠心肌组织炎症反应相关指标比较

LPS注射6 h后检测小鼠心肌组织炎症反应相关指标显示,与control组相比,LPS组小鼠心肌组织中炎症因子IL-1β和TNF-α的含量显著增加,心肌组织中性粒细胞浸润明显上升(P<0.01);与LPS组相比,给予THC处理后,LPS+THC组小鼠心肌组织中IL-1β和TNF-α的含量显著降低,心肌组织中性粒细胞浸润程度明显下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症小鼠心肌组织炎症反应的抑制作用则被明显逆转(P<0.01,见图3)。

与control组相比,##P <0.01;与LPS组相比,* * P <0.01;与LPS+THC组相比,&&P <0.01图3 各组小鼠心肌组织炎症反应相关指标比较Figure 3 Comparison of the inflammatory response-related indicators in myocardial tissue between groups

2.5 各组小鼠心肌细胞凋亡水平比较

LPS注射6 h后检测小鼠心肌细胞凋亡水平显示,与control组相比,LPS组小鼠心肌细胞凋亡水平明显上升(P<0.01);与LPS组相比,给予THC处理后,LPS+THC组小鼠心肌细胞凋亡水平明显下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症小鼠心肌细胞凋亡的抑制作用则被明显逆转(P<0.01,见图4)。

2.6 各组小鼠心肌组织SIRT1蛋白表达比较

LPS注射6 h后检测小鼠心肌组织检测SIRT1蛋白表达情况显示,与control组相比,LPS组小鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显下降,Ac-foxo1的表达水平明显升高(P<0.01);与LPS组相比,给予THC处理后,LPS+THC组小鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显升高,Ac-foxo1的表达水平明显下降(P<0.01);而EX527+LPS+THC组小鼠中THC对脓毒血症小鼠心肌组织SIRT1信号表达的促进作用则被明显逆转(P<0.01,见图5)。

3 讨论

脓毒血症是一种由病原微生物感染引起,最终导致机体多器官功能衰竭的疾病综合征,严重的脓毒血症和感染性休克是危重患者救治过程中的重要医疗问题[11]。心脏是脓毒血症状态下的主要受累器官并且后果严重,其对心肌损伤的程度是患者预后的关键[12]。脓毒血症心肌损伤可表现为不同类型的心功能障碍,引起射血分数下降,心输出量不足,显著增加脓毒血症患者的死亡风险[13]。本研究同样观察到内毒素脂多糖诱导的小鼠脓毒血症模型中其心肌损伤明显,表现为LPS组小鼠的血清中CK、CK-MB和TnI活性均显著升高,同时其心脏功能也严重受损,表现为LPS组小鼠的左心室射血分数和左心室短轴缩短率均显著降低。因此,寻找能缓解脓毒血症心肌损伤的保护性药物对于提高脓毒症患者的生存率具有非常重要的临床意义。

图4 各组小鼠心肌细胞凋亡水平比较Figure 4 Comparison of cardiomyocyte apoptosis between groups

与control组相比,##P <0.01;与LPS组相比,* * P <0.01;与LPS+THC组相比,&&P <0.01图5 各组小鼠心肌组织SIRT1蛋白表达比较Figure 5 Comparison of the expressions of SIRT1 protein in myocardial tissue between groups

目前对于脓毒血症时心肌损伤的具体作用机制尚未完全阐明,近年来研究发现,炎症反应和氧化应激损伤在脓毒血症心肌损伤的发病过程中起到关键作用。促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β以自分泌和旁分泌的方式触发炎症级联反应,对心肌产生负性作用,导致脓毒症心肌损伤而最终出现心功能障碍[14,15]。并且,在识别微生物产物和宿主防御感染过程中起到重要作用的Toll样受体的失调也可通过提高心肌组织和血清中炎症因子水平和增强嗜中性粒细胞迁移,增强机体炎症反应,进而促进脓毒血症的心脏功能障碍[16,17]。同时,在脓毒血症状态下,机体氧化与抗氧化状态严重失衡,大量线粒体和非线粒体来源的活性氧簇可通过直接损伤心肌细胞的膜结构及细胞器,导致功能障碍甚至使细胞自溶对心脏造成损伤[18,19]。此外,氧化应激损伤与炎症反应一方面相互促进,一方面又可触发调亡效应,引起心肌细胞凋亡,损害心肌细胞功能[20]。本研究同样观察到,LPS可明显增加心肌组织内MDA含量和ROS的生成,并降低SOD的含量,上调gp91phox蛋白的表达;同时LPS组小鼠心肌组织中性粒细胞浸润明显增强,炎症因子IL-1β和TNF-α的产生显著增加,继而导致LPS组小鼠心肌细胞凋亡率明显上升。因此,寻找有效的抗氧化应激与抗炎治疗措施可能是减轻脓毒血症小鼠心肌损伤的有效策略。

近年来,一种具有多重药理活性、对多种心血管疾病具有治疗和预防作用的物质四氢姜黄素日益受到关注[21]。陈旭等[5]研究发现,四氢姜黄素通过抑制氧化应激损伤和凋亡改善多柔比星急性心脏毒性。冯建梅等[6]研究结果证实,四氢姜黄素预处理可通过降低氧化应激和凋亡,最终减轻心肌细胞缺血/再灌注损伤。江丽青等[7]研究结果表明,四氢姜黄素可以明显改善2型糖尿病小鼠糖脂代谢异常,并发挥大血管保护作用。曹星等[8]观察到四氢姜黄素能够有效减轻压力负荷引起的病理性心肌肥厚。然而,四氢姜黄素能否减轻脓毒血症小鼠心肌损伤及其作用机制均有待进一步探究。本研究结果发现,与LPS组小鼠相比,给予四氢姜黄素处理可以明显降低LPS+THC组小鼠心肌细胞的MDA含量并增加SOD含量,抑制蛋白gp91phox的表达和ROS的生成;同时四氢姜黄素处理可以显著抑制LPS+THC组小鼠心肌组织中性粒细胞浸润和炎症因子IL-1β和TNF-α的产生,进而减轻了心肌组织氧化应激损伤与炎症反应,降低了心肌细胞的凋亡,保护了小鼠的心脏功能。综上,我们进一步证实了,四氢姜黄素同样具有抗脓毒血症小鼠心肌损伤的保护效应,其作用机制与抗氧化和抗炎活性密切相关。

SIRT1是sirtuin家族的成员之一,其特征是具有高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合催化结构域,被认为在多种心血管疾病的发展和治疗中发挥有益作用[22]。越来越多的研究也指出SIRT1可能参与脓毒血症心肌损伤发生过程中炎症、氧化应激和能量代谢的改变[9,23]。尤其值得关注的是,激活SIRT1信号在减轻脓毒血症心肌损伤中发挥了重要角色[24-27]。此外研究报道,SIRT1可以与下游分子foxo1结合并参与foxo1的去乙酰化。foxo1分子去乙酰化后可以抑制炎症因子及凋亡相关分子的表达,并且增加SOD等抗氧化剂的合成,进而发挥了SIRT1分子的细胞保护作用[28,29]。本研究同样观察到,与control组相比,LPS组小鼠心肌组织中SIRT1信号显著被抑制,foxo1的乙酰化程度明显增高,给予四氢姜黄素处理可以明显提高LPS+THC组小鼠心肌组织内SIRT1信号的表达,降低了foxo1的乙酰化程度,进而介导了四氢姜黄素的抗炎、抗氧化和抑制凋亡的作用,减轻了小鼠脓毒血症心肌损伤;而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则明显逆转了THC对LPS心肌损伤的保护效果。

综上所述,本研究发现四氢姜黄素可以通过激活SIRT1信号通路抑制脓毒血症小鼠心肌炎症反应和氧化应激损伤,减轻心肌细胞凋亡,进而保护了心脏功能。本研究首次证实了四氢姜黄素可能是减轻脓毒血症心肌损伤新的有效措施,为临床上应用四氢姜黄素治疗脓毒血症心脏并发症的患者提供了新的理论依据。