缺血缺氧性脑病新生儿microRNA-21表达及临床价值

卞伟妮，吴新婷

（西安医学院第二附属医院，陕西 西安710038）

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是围生期新生儿发生窒息后产生的严重并发症，可造成新生儿神经系统脑水肿和脑坏死[1]。临床研究显示，约50%的脑瘫患儿是由HIE 引起的。引发HIE 原因较多，如母体妊娠高血压、胎盘异常、胎盘早剥、胎儿发育迟缓、脐带脱落、分娩中出现脐带绕颈和打结等[2]。因此，发现新的生物学标志物用于早期诊断HIE及预测HIE 的预后显得尤为重要[3-4]。

MicroRNA 是一条具有20～25 个核苷酸序列的内源性非编码RNA，广泛参与到器官发育，细胞增殖、分化、迁移和凋亡，肿瘤发生及代谢等各种生理病理过程[5-7]。本实验通过检测血清microRNA-21（miR-21）在HIE 患儿和正常新生儿之间的表达差异，以及与脑功能评分（NBNA）的关系，以探究miR-21 在HIE 诊断和预后预测的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年3月—2019年6月西安医学院第二附属医院新生儿HIE 患儿56 例（HIE 组）。其中，男性31 例，女性25 例；剖宫产20 例，顺产36 例；胎龄38～40 周，平均（39.1±0.8）周；出生体重2 750～4 100 g，平均（3 219.7±251.6）g。纳入标准：符合世界卫生组织制定的新生儿缺氧缺血性脑病的诊断标准[8]；母体妊娠期间无其他并发症；出生体重2 630～4 000 g；胎龄37～42 周。排除标准：先天性病变引发的脑损伤者；伴有颅内出血、宫内窘迫因素引发的感染和抽搐；对本研究结果会产生影响的感染性病变、肝肾功能障碍者。同时选取健康新生儿60 例为对照组。其中男性28 例，女性32 例；剖宫产22 例，顺产38 例；胎龄38～40 周，平均（39.0±0.6）周；出生体重2 600～4 215 g，平均（3 180±247.2）g。

1.2 研究对象血液样本采集

HIE 组在出生后24 h（急性期）、7 d（恢复期）分别采集2 ml 股静脉血；对照组于出生后24 h采集2 ml 股静脉血。血液样品于常温下放置1 h 后3 000 r/min 离心20 min，取上层1 ml 血清至EP 管中，于-80℃冰箱冷冻保存。

1.3 试剂

RNAsimple 总RNA 提取试剂盒（DP419）购自天根（北京）生物科技有限公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息见表1。实时定量PCR 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。实时定量PCR 仪购自美国Bio-Red 公司。置入-80℃冰箱冷冻保存（购自美国Thermo Fisher公司）。

表1 引物序列

1.4 实时荧光定量PCR检测miRNA的表达

通过总RNA 提取试剂盒提取血液样本中的总RNA，进行擦除DNA 和逆转录操作，得到cDNA 用于逆转录，按照PCR 试剂盒说明书配制逆转录体系。实时荧光定量PCR 采取二步法，条件如下：95℃预变性30 s；PCR 反应，95℃预变性5 s，60℃变性30 s。共循环40 次。通过2-ΔΔCt法检测miR-21的表达水平。

1.5 新生儿神经行为测定

出生后30 d 对两组新生儿进行新生儿神经行为测定（neurobehavioral measurement in neonates,NBNA）[9]，包括27 项行为能力和20 项神经反射，总分40 分，评分越高表明新生儿神经功能越好。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 法，绘制ROC 曲线。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较

两组性别构成、生产方式、体重、胎龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组一般情况的比较

2.2 两组血清miR-21表达水平的比较

在HIE 发生的急性期（出生后24 h），HIE 组患儿血清miR-21 表达水平与对照组新生儿比较，差异有统计学意义（t=10.470，P=0.000），HIE 组患儿血清miR-21 表达水平（1.857±0.136）高于对照组新生儿（0.826±0.127）。见图1。

图1 血清miR-21表达水平的比较

2.3 急性期miR-21表达的诊断学意义

通过绘制miR-21在两组血清中表达水平的ROC曲线，评价miR-21 对新生儿HIE 的诊断效能。ROC曲线下面积以0.5作为参考界值，miR-21表达水平对HIE 预测的ROC曲线下面积为0.758 （95% CI：67.32，85.78）。结果提示，血清miR-21 的表达水平对诊断新生儿HIE具有较高的诊断价值。见图2。

图2 miR-21诊断新生儿HIE的ROC曲线

2.4 恢复期miR-21表达水平与NBNA的相关性分析

新生儿HIE患儿治疗7 d时miR-21血清表达水平与恢复30 d 时NBNA 评分呈负相关（r=-0.746，P=0.000）。见图3。

图3 恢复期miR-21与NBNA评分的相关性

3 讨论

近年来随着居民生活水平的提高，产前和新生儿护理条件得到显著改善。但HIE 仍然是全世界新生儿发病和死亡的重要原因[10]。新生儿HIE 并非罕见病，在新生儿中的发病率约为2‰～3‰。在一些发展中国家，其发生频率甚至可上升到26‰。这些HIE 患儿中约24%在急性期死亡；其余存活的新生儿中，也会伴随脑瘫（10%～20%），视觉和听觉障碍（约40%）以及运动和行为损害，例如癫痫，整体发育迟缓和自闭症等后遗症[11-12]。HIE 对社会和家庭带来了巨大的经济和心理负担，现在已有大量的研究聚焦HIE 的诊断、干预和治疗。

HIE 可以发生于产前，围生期或产后等各个时期，呈急性或慢性发展[13]。在损伤的潜伏期（1～6 h），发生氧化代谢、炎症和凋亡级联反应的激活。HIE损伤后6～48 h，发生高能磷酸化合物的消耗以及兴奋性神经递质和自由基的释放[14-15]。在急性缺血长达1 个月后，发生晚期细胞死亡，受伤的大脑重塑和星形胶质细胞的增生[16-18]。HIE 的基本病理过程包括：线粒体损伤、自由基生成、一氧化氮合成酶（NOS）的激活、炎症反应、神经元细胞凋亡。

MicroRNA（miRNA）是由基因组内的短反向重复编码的约22 个核苷酸的内源非编码单链RNA[19]。第一个miRNA，lin-4，于1993年在线虫中被发现。脊椎动物中miRNA 的存在于2001年得到证实。目前，已有超过800 种miRNA 在人类中被克隆和测序，并且人类基因组中miRNA 基因的估计数量高达1 000。miR-21 由单个基因编码，在各种脊椎动物物种中表现出强大的进化保守性[20]。

本研究发现，miR-21 在新生儿HIE 急性期大量表达，可作为新生儿HIE 的早期标志物，为HIE的诊断提供新的生物学标志物。而在HIE 恢复期，给予常规治疗的HIE 患儿，发病后7 d 的miR-21 表达水平与发病30 d 后NBNA 评分呈负相关，说明恢复早期miR-21 水平对HIE 患儿后期神经功能恢复具有预测作用，为HIE 的后期康复治疗提供重要依据。miR-21 的生物学作用在肿瘤研究中得到了很好的证实。实际上，已发现miR-21 在多种肿瘤组织中过表达，同时miR-21 可作为胰腺癌、结肠癌等多种癌症的生物学标志物。在免疫系统，miR-21可通过介导Th17 细胞分化参与多种自身免疫性疾病的发展[20-22]。在循环系统中，miR-21 通过肾素-血管紧张素系统、炎症因子激活和内皮功能障碍参与高血压的发病和靶器官的损伤[23]。而miR-21 在HIE 患儿疾病发生、发展中发挥的作用可能包括以下几个方面：①miR-21 通过直接作用于PDCD4 分子调节免疫功能，降低IL-6 水平，升高IL-10 水平[24-25]，并可以调节Smad7 分子通过Th17 细胞调节免疫功能[26-27]；②miR-21 通过PTEN-Akt 信号通路作用于Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 等分子，抑制神经元细胞凋亡；③miR-21 通过PDCD4 分子和PTEN-Akt 信号通路抑制星形胶质细胞的增生，表性变化和病理性肥大。

综上所述，本研究通过观察新生儿HIE 患儿血清miR-21 表达水平和NBNA 评分，发现miR-21 表达水平在HIE发病早期上升，并且在恢复期miR-21水平与NBNA 评分呈负相关。miR-21 对HIE 具有早期诊断意义，miR-21 对HIE 的病情进展具有早期预测效果，为HIE 的早期诊断和病情进展提供新的依据和生物学标志物。