肉制品中挥发性N-亚硝胺化合物检测技术研究进展

梁秀清　杨颖　张红霞　王艳丽　李芳芳　刘艳明

摘 要：挥发性N-亚硝胺化合物在肉制品中痕量存在，其分离、分析十分困难。本文综述肉制品中挥发性亚硝胺检测技术研究进展，主要介绍5 种前处理技术包括水蒸气蒸馏法、固相萃取法、固相微萃取法、微波辅助分散液-液微萃取法和分散固相萃取法，并概述气相色谱法、液相色谱法对多种挥发性亚硝胺定性定量分析的应用进展。最后指出肉制品中挥发性亚硝胺检测技术发展中面临的困难以及未来发展趋势。

关键词：肉制品;挥发性;N-亚硝胺化合物;检测技术

Recent Progress in Techniques for Detection of Volatile N-Nitrosamines in Meat Products

LIANG Xiuqing， YANG Ying， ZHANG Hongxia， WANG Yanli， LI Fangfang， LIU Yanming*

（Shandong Institute for Food and Drug Control， Shandong Research Center of Engineering and Technology for

Safety Inspection of Food and Drug， Jinan 250101， China）

Abstract： The separation and analysis of volatile N-nitrosamines in meat products are difficult tasks because they are present at trace levels. In this paper， advances in techniques for the detection of volatile N-nitrosamines in meat products are summarized. Five pretreatment techniques including steam distillation， solid-phase extraction， solid-phase micro-extraction， microwave-assisted extraction coupled with dispersive liquid-liquid micro-extraction and dispersive solid-phase extraction are outlined. The application of gas chromatography and liquid chromatography in qualitative and quantitative analysis of volatile N-nitrosamines is also reviewed. Finally， the difficulties in the development of new techniques for the detection of volatile nitrosamines in meat products and future trends are discussed.

Keywords： meat products; volatile; N-nitrosamines; detection technology

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279

中图分类号：TS251.6

文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）01-0098-07

引文格式：

梁秀清， 杨颖， 张红霞， 等. 肉制品中挥发性N-亚硝胺化合物检测技术研究进展[J]. 肉类研究， 2020， 35（1）： 98-104. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279.    http：//www.rlyj.net.cn

LIANG Xiuqing， YANG Ying， ZHANG Hongxia， et al. Recent progress in techniques for detection of volatile N-nitrosamines in meat products[J]. Meat Research， 2020， 35（1）： 98-104. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279.    http：//www.rlyj.net.cn

亚硝胺是具有强毒性的化学物质，具有强致畸性和致癌性。亚硝胺的致癌性还存在器官特异性，近年来研究表明某些消化系统肿瘤，如胃癌、食管癌的发病率与膳食中摄入的亚硝胺密切相关[1]。不同的亚硝胺毒性差别很大，其中挥发性亚硝胺尤其是N-亚硝基二甲胺毒性最强。常见的挥发性亚硝胺见表1。

亚硝酸盐和硝酸盐是最常见的亚硝化剂，经常作为防腐剂和护色剂用于肉制品中。使用亚硝酸盐腌制肉可产生令人愉悦的色泽和风味，还能有效抑制肉毒杆菌的生长，延缓氧化酸败[2-3]。我国GB 2760—2014《食品安全国家标准 食物添加剂使用标准》规定腌腊肉、酱卤肉、肉灌肠、发酵肉等肉制品中亚硝酸钠的最大残留量为30 mg/kg。肉中蛋白质含量丰富，在加工过程中蛋白质容易分解产生肽类、氨基酸和胺类物质，这些物质和亚硝酸盐、硝酸盐会在一定条件下反应生成亚硝胺[4]。

由于挥发性亚硝胺的毒性及其对食品安全造成的极大危害，国内外有关肉制品中亚硝胺分析测定的研究主要集中于揮发性亚硝胺化合物。目前，许多国家均制定了对食品中挥发性亚硝胺的限量要求。美国农业部规定腌肉制品中挥发性N-亚硝胺化合物总量的限量为10 ?g/kg[5];加拿大食品检验局规定腌肉制品中NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NMOR的限量均为10 ?g/kg，NPYR的限量为15 ?g/kg[6];智利规定肉制品中NDMA的限量为30 ?g/kg[6];爱沙尼亚规定NDMA和NDEA总量在肉和肉制品中限量为2 ?g/kg，在烟熏肉制品中为4 ?g/kg[7]，在新鲜鱼和烟熏鱼中为3 ?g/kg[8];俄罗斯规定N-亚硝胺化合物总量在生食品中限量为2 ?g/kg，在烟熏食品中为4 ?g/kg[9]。我国GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定肉类及肉制品和水产品中NDMA限量分别为3.0 ?g/kg和4.0 ?g/kg。

肉制品中挥发性亚硝胺含量极低，且肉制品基质复杂，因此，肉制品中挥发性亚硝胺的分析检测不仅需要高灵敏度的精密检测技术，还需要简捷有效的前处理技术。目前，肉制品中挥发性亚硝胺的前处理技术主要有水蒸气蒸馏法、固相萃取法、固相微萃取法、微波消解-液-液微萃取法、分散固相萃取法等;仪器检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等。本文对肉制品中挥发性亚硝胺检测中的前处理方法和仪器方法，包括前处理过程、仪器条件和检测结果进行综述，并分析检测方法的优缺点，以期为亚硝胺相关分析工作提供相应的技术选择。

1 样品前处理技术

由于含量低且基质复杂，无论何种检测方法，样品的前处理技术均是肉制品中挥发性亚硝胺检测的难点和关键点。目前，样品的前处理方法主要有水蒸气蒸馏法、固相萃取法、固相微萃取法、微波消解-液-液微萃取法、分散固相萃取法等。

1.1 水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法是指将含有挥发性成分的样品与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。挥发性亚硝胺具有亲水性和强极性特点，可以被水蒸气蒸馏法有效提取。该法是食品尤其是肉制品中挥发性亚硝胺检测的传统方法，不仅能有效去除大部分的非挥发性杂质，还可实现样品高倍数浓缩，提高方法的检出限以满足检验的要求。目前，我国GB 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中样品前处理采用此法。Byun等[2]采用该法提取发酵肠中NDMA和NPYR，考察辐照处理对其含量的影响。李玲等[10]使用水蒸气蒸馏法测定香肠中9 种挥发性亚硝胺，检出限为0.02～0.08 ?g/kg、定量限为0.05～0.2 ?g/kg，回收率为62%～78%，回收率偏低，分析其可能的原因是9 种亚硝胺具有强挥发性，在高倍数浓缩过程中容易造成损失。马兴等[12]自主研发快速水蒸气蒸馏仪，建立快速水蒸气蒸馏法测定肉制品和水产制品中13 种N-亚硝胺的含量，平均蒸馏时间仅需15 min，大大提高了工作效率。水蒸气蒸馏法前处理步骤多、操作繁琐，且由于肉制品中脂肪含量较高，使用该方法会有大量脂肪被同时提取出，在随后的液-液萃取过程中容易产生乳化现象，为后期的提取净化造成不便，不适用于高通量分析;有机溶剂用量大，不利于环境和操作人员保护。

1.2 固相萃取法

固相萃取技术是20世纪70年代发展起来的一种替代液-液萃取法的集样品分离、富集、净化、溶剂转换于一体的技术。该技术能有效去除干扰物质，操作简便，很快引起了学者的关注。Pensabene[13-14]、Fiddler[15]等建立固相萃取技术测定培根中NPYR、NPIP的方法，但该方法主要用于单一基质中单一亚硝胺化合物的分析。1997年，Raoul等[16]采用基质分散固相萃取法，选用商品化硅藻土和Florisil硅土填料，建立两步固相萃取法测定香肠、煎鱼等不同基质中8 种常见挥发性亚硝胺的方法，扩大了固相萃取技术在肉制品中挥发性亚硝胺检测的分析范围，但由于柱效较低，以及目标物性质差异较大，该方法对不同亚硝胺的回收率差别较大，其中毒性最大的NDMA回收率仅为40%～58%。随后，很多学者[17-19]改良了两步固相萃取法，并将其用于不同肉制品中多种挥发性亚硝胺的分析。随着固相萃取技术的发展，商品化固相萃取柱柱效高、稳定性好，Sannino等[20]测定肉制品中9 种挥发性亚硝胺的含量时选用商品化ChemElut和Florisil固相萃取柱，所得方法精密度高、重复性好，回收率为95%～110%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为5%～11%。张建斌等[21]考察多种不同固相萃取柱的萃取效果，综合考虑回收率和对脂肪和色素的去除发现，活性炭效果最佳。而何淑娟等[22]则认为PSA-C18复合固相萃取柱萃取效果更佳。固相萃取法适用于肉制品中挥发性亚硝胺含量的测定，但由于肉制品基质复杂，净化过程中容易出现堵塞管柱、解吸时间长的问题，提取净化的难度较大。近年来国内学者[23-24]研究发现，使用氢氧化钡碱性溶液处理样品，不仅能除去样品中大量油脂，有效提取N-亚硝胺，还能促使样品溶液蛋白沉淀，使其黏度变小，有利于后续固相萃取柱净化富集。

1.3 固相微萃取法

固相微萃取技术是1990年由Pawliszyn等建立，是将样品中微量组分的提取、浓缩、解吸、进样等步骤集于一体的样品制备技术[25]，在复杂基质中挥发性、半挥发性化合物的分析中应用广泛。由于其无萃取溶剂、环境友好、检测快速方便，固相微萃取技术在不同样品基质中亚硝胺的测定中也得到了较好的应用和发展[26-28]。Sen等[29]将固相微萃取技术应用于肉制品中挥发性亚硝胺的检测，结果表明，该方法能快速有效测定烟熏火腿中NDBA和N-亚硝基苄基胺，回收率分别为102%～112%、68.9%～84.4%，检出限分别为3、1 ?g/kg;而对NDMA、NEMA、NPYR、NPIP、NMOR 5 种亚硝胺无法有效提取。因亚硝胺性质差异大，纤维萃取头涂层孔径大小各异，因此，不同纤维萃取头对不同亚硝胺萃取效果不同[30-32]，如DVB/PDMS纤维萃取头只能有效萃取5 種挥发性亚硝胺，而CAR/PDMS纤维萃取头则对9 种挥发性亚硝胺均有较满意的萃取效果。固相微萃取实验中容易存在萃取不充分、解吸不完全、目标物残留的问题，造成检测结果重复性差。Ventanas等[30]研究发现9 种挥发性亚硝胺萃取结果的RSD为14.3%～91.03%。固相微萃取法操作简单方便，为肉制品中挥发性亚硝胺的检测提供了新思路，但该方法检出限高，对肉制品中含量极低的亚硝胺很难准确定性定量检测。张甜[33]、杨华[34]等考察3 种不同纤维萃取头对9 种挥发性N-亚硝胺的萃取效果，认为PDMS/DVB/CAR纤维萃取头萃取效果最佳，并优化了其最佳萃取条件。在固相微萃取中，纤维萃取头的选择是影响挥发性亚硝胺提取的重要因素，而纤维萃取头价格较为昂贵、使用次数有限，因此该方法也不适用于高通量的检测。

1.4 微波辅助分散液-液微萃取法

微波萃取技术利用微波加热的方式，快速、高效地将分析物从复杂固体样品基质释放到溶液中。Rezaee等[35]报道，分散液-液微萃取是一种基于目标物在样品溶液和小体积萃取剂之间平衡分配的新型样品前处理技术。Campillo等[36]将微波萃取技术与分散液-液微萃取法结合，建立肉制品中9 种挥发性亚硝胺的分析方法，并优化微波辅助萃取和分散液-液萃取参数，所得方法灵敏度高，在较少称样量下仍然有较低的检出限，9 种挥发性亚硝胺的检出限为0.12～0.56 ?g/kg。Amelin[37]和Ramezani[38]等也采用微波辅助分散液-液微萃取法分析香肠、熏制肉制品中7 种挥发性亚硝胺，检出限分别为0.1～0.5 ?g/kg和0.11～0.48 ?g/kg，与Campillo等[36]的研究结果基本一致。微波辅助分散液-液微萃取法萃取效率和富集倍数较高，但由于萃取剂使用量非常小，是微升级别，在实际检测中对检验人员操作要求较高。

1.5 分散固相萃取法

分散固相萃取法最早是由Anastassiades等[39]于2003年首先提出的一种样品前处理方法。样品溶液中加入适当的分散固相萃取吸附剂，利用吸附剂分散在样品溶液中吸附杂质，达到净化效果。与分散固相萃取法不同，分散固相微萃取是利用吸附剂吸附目标物，再通过小体积有机溶剂将目标物反萃取。Fu等[40]将分散固相微萃取方法用于测定水样中5 种挥发性亚硝胺（NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA）;随后，又将分散固相微萃取法与微波辅助萃取法结合用于肉制品中挥发性亚硝胺的测定，分析5 种不同肉制品中7 种挥发性亚硝胺，回收率为60%～105%[41]。

QuEChERS法是将分散固相萃取与固-液萃取相结合建立的一种快速、简单、廉价、有效、可靠和安全的样品前处理技术[42]。Lehotay等[43]将QuEChERS法用于亚硝胺的检测，建立肉制品中5 种挥发性亚硝胺的QuEChERS分析方法，该方法准确性好、灵敏度高，5 种挥发性亚硝胺加标回收率70%～120%，RSD均小于20%，检出限0.1 ng/g。国内学者[44-47]也使用QuEChERS法分析肉制品、中式咸鱼等不同样品中9 种挥发性亚硝胺的含量。QuEChERS法操作简单、提取净化效果好、成本低廉、灵敏度高、选择性好，能有效地提高检测速率和检测通量。

2 仪器分析技术

随着分析化学的发展和新仪器的开发应用，食品中亚硝胺的检测技术也不断突破，选择性和灵敏度都在不断提高，目前常用的亚硝胺分析方法主要包括气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等。

2.1 气相色谱法

气相色谱法是20世纪50年代迅速发展起来的一种分离和分析方法，特别适用于气体混合物和挥发性化合物的检测。由于气相色谱技术具有技术成熟、灵敏度高、分离效能高、选择性高、可联合多种检测器等优点已被广泛用于食品安全检测中。气相色譜法是目前检测食品中挥发性N-亚硝胺化合物最常用的方法之一。一些学者使用氢火焰离子化检测器[24，48-49]、氮磷检测器[33-34，50]分析挥发性亚硝胺，但这2 种检测器灵敏度差且缺乏特异性，并不适用于肉制品中挥发性亚硝胺的痕量分析。

20世纪70年代，热能分析仪和氮化学发光检测器作为亚硝胺特异性检测器，由于其专用性强、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽，引起了研究者关注。亚硝胺检测器的检测机理分为2 步：裂解和化学发光。N-亚硝胺化合物在合适条件下，N-NO键裂解生成NO自由基，NO自由基与臭氧反应在室温下迅速生成激发态NO*，当激发态NO*衰减回到基态时，会发出特征近红外辐射，发出的光谱强度与N-亚硝胺浓度成正比，通过检测光谱强度可以线性定量分析N-亚硝胺含量。气相色谱-热能分析仪法已被广泛用于肉制品中挥发性亚硝胺的分析研究[12，51-52]。GB 5009.26—2016中第二法使用气相色谱-热能分析仪对肉及肉制品中NDMA进行测定，方法检出限为0.5 ?g/kg。Grebel等[53]认为氮化学发光检测器对7 种挥发性亚硝胺的选择性、灵敏度均优于氮磷检测器。Ozel[18]、Kocak[19]等采用全二维气相色谱-氮化学发光检测器分析肉制品、烤羊肉、蔬菜等不同复杂食品基质中亚硝胺的含量，该方法利用全二维气相色谱的高效分离能力，降低了对复杂基质前处理过程中净化要求，同时提高了灵敏度，再结合亚硝胺特异性的氮化学发光检测器，确保方法定性分析的准确性。但是，由于全二维气相色谱仪价格昂贵，且2 种亚硝胺检测器应用范围窄，适应性不强，仅适用于亚硝胺化合物的检测，实验室配备率低。

2.2 气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱联用技术结合了气相色谱的分离能力和质谱确定分子质量和分子结构的能力，对于分析和鉴定复杂多组分有机混合物，是目前公认的最为有效的检测技术之一，已广泛用于挥发性亚硝胺的测定。电子轰击离子化和化学离子化是气相色谱-质谱联用技术中常见的离子化方式。电子轰击离子化技术使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离，产生标准化的质谱图。国内外学者运用气相色谱-电子轰击离子源-质谱建立肉制品中挥发性亚硝胺的分析方法[36，54-55]。但因肉制品基质复杂，基质干扰严重，对低分子质量亚硝胺尤其是NDMA的定性定量分析仍存在困难，容易出现假阳性。使用化学离子化技术可以避免气相色谱-电子轰击离子源-质谱测定时出现的背景干扰严重、响应差的问题，使低分子质量亚硝胺有更好的质谱特性和更高的灵敏度。Yurchenko等[8，17]报道用氨气为反应气的气相色谱-电子轰击离子源-质谱法，分析294 份鱼、386 份肉制品中5 种挥发性亚硝胺的含量，5 种挥发性亚硝胺的检出限为0.09 ?g/kg。文献[6，41]还报道采用气相色谱-电子轰击离子源-质谱方法时，与氨气相比，以甲醇为反应气毒性相对较低，对分析人员更安全，检测成本也更低;此外，该方法产生的离子碎片更少，分析挥发性亚硝胺时不会产生加合离子，灵敏度和特异性好。

2.3 气相色谱-串联质谱法

随着质谱技术的发展，气相色谱-三重四极杆串联质谱越来越普及，其抗干扰能力较单极质谱强，可以在低分子质量区域提供高灵敏度和高选择性的分析，已逐渐成为亚硝胺检测的常规手段。基质效应是采用质谱分析时普遍遇到的问题，基质效应可增强或减弱目标物的信号，从而影响仪器的灵敏度和重复性，影响检测结果的准确度。孔祥一等[56]研究表明9 种N-亚硝胺在动物源性食品中表现出较强的基质抑制效应。采用同位素内标法定量，不仅能有效消除基质效应，还能减少前处理过程中带来的误差，有效地保证定性、定量结果的准确度。研究[43，57-58]中关于基于电子轰击电离源的肉制品中低水平多种挥发性亚硝胺低的气相色谱-串联质谱检测方法的报道较多。Sannino等[20]选择化学离子源、氨气作反应气，采用同位素内标法定量以消除基质效应，建立气相色谱-串联质谱法检测肉制品中9 种挥发性亚硝胺的含量。赵庄[59]和朱萌萌[60]等采用空白基质匹配标准曲线定量，不仅检测效果与采用同位素内标法定量相同，还降低了分析成本。气相色谱-三重四极杆串联质谱法能够满足肉制品中挥发性亚硝胺的残留分析。

2.4 液相色谱法

液相色谱法检测挥发性亚硝胺的报道较少。液相色谱法检测亚硝胺时需要将亚硝胺衍生化转变为荧光响应物质，如用丹璜酰氯衍生化。Komarova等[61]采用氢溴酸-乙酸溶液使亚硝胺分解为胺类物质和亚硝根离子，对相应的胺类物质进行丹璜酰氯衍生化，用荧光检测器测定熏鱼、肉制品等食品中NDMA、NDEA的含量，检测限分别为0.7、2.2 ng/g，回收率分别为（72.0±7.4）%、（74.0±5.8）%。Lu等[62]采用2-（11H-苯（a）咔唑）乙基氯甲酸酯作为衍生化试剂，建立烤肠、酱牛肉等食品中5 种挥发性亚硝胺的高效液相色谱检测方法，检测限为0.01～0.07 ng/g，回收率为92.80%～102.10%，RSD为1.9%～3.2%。肖付刚等[63]采用二极管阵列检测器，蔡鲁峰等[64]选择紫外检测器，采用高效液相色谱法时均不需衍生化，可直接检测肉制品中9 种N-亚硝胺。

2.5 高效液相色谱-串联质谱法

高效液相色谱-串联质谱法可以直接检测亚硝胺，具有简单、灵敏度好和分析速率快等优点。在分析复杂基质样品时，高效液相色谱-串联质谱法相对于液相色谱法表现出更好的选择性、准确度以及更低的定量限。Herrmann等[65-68]建立同时测定肉制品中挥发性、非挥发性亚硝胺的液相色谱-大气压化学电离源/电喷雾电离源-串联质谱方法，两类亚硝胺的检出限分别为0.2 μg/kg和1 μg/kg，并分析丹麦肉制品中亚硝胺产生的因素和暴露量。国内学者[69-70]研究表明大气压化学电离源模式下NDMA的基质干扰小，灵敏度也较电子喷雾离子源模式下高，能满足GB 2762—2017中对肉制品和水产品的限量要求。Lehotay等[43]认为液相色谱-串联质谱法能有效分析培根中的亚硝胺，且方法准确性和重复性好。目前运用此方法分析肉制品中揮发性亚硝胺含量的研究较少，但仍具一定的发展前景。

2.6 其他方法

检测亚硝胺的方法还有薄层色谱法、紫外-可见分光光度法、电化学法、胶束电动毛细管色谱法等，由于这些方法存在一定的局限性，如灵敏度低、选择性差、准确度低等，逐渐被大型仪器检测所代替。

3 结 语

随着对亚硝胺污染问题的重视以及分析技术和检测仪器的发展进步，有关肉制品中挥发性亚硝胺的研究取得很大进展，检测方法和许多肉制品中的污染数据日益完善。但由于样品基质成分复杂，前处理过程中萃取、净化难度大，肉制品中痕量分析挥发性N-亚硝胺化合物时，选择合适的前处理方法和高选择性、高灵敏度的分离检测技术仍面临挑战。QuEChERS法操作简单，提取净化效果好，能有效地提高检测速率和通量，在肉制品中亚硝胺的分析中具有很好的应用前景。色谱-串联质谱技术在测定N-亚硝胺化合物方面应用越来越广泛，检测灵敏度和准确性也有大幅提升。此外，在线萃取净化新技术、基于酶联免疫或胶体金试纸法的快速检测技术等在食品分析中的应用逐渐增多，而在亚硝胺检测中应用较少，有待进一步研究。对亚硝胺检测技术进行深入研究，对实际生产中有效控制肉制品中N-亚硝胺含量，保障肉制品食用安全性和促进肉制品产业发展均具有非常重要的意义。

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收稿日期：2020-11-23

第一作者简介：梁秀清（1984—）（ORCID： 0000-0001-5665-0393），女，工程师，硕士，研究方向为食品安全检测。

E-mail： 296822169@qq.com

通信作者简介：刘艳明（1981—）（ORCID： 0000-0002-2498-5460），女，研究员，博士，研究方向为食品安全检测。

E-mail： msymliu@163.com