高效液相色谱-串联质谱法对烤鸭皮色素的组成和结构分析

郝 敏，夏 强，何 俊，孙杨赢，党亚丽，曹锦轩，潘道东

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

烤鸭是我国传统的烧烤类肉制品，以其独特的风味和品质，深受广大消费者喜爱。烤鸭的加工工艺主要包括原料的处理、烫皮、上糖色、晾坯及烤制等，这种特殊的制作方法赋予了烤鸭皮脆、味美、肉质鲜嫩、色泽鲜红、油光闪闪的特点。对消费者来说，许多适口性特征，如颜色、外观、质地和风味，都是影响肉制品选择和接受的重要因素。因此，烤鸭工业的持续目标之一就是改进加工，提高烤鸭品质。烤鸭皮色泽是决定烤鸭品质的一个重要指标。鸭皮颜色会直接影响消费者对烤鸭的接受程度，对消费者而言，适度的焦黄色可以增加食欲，过度的焦黄则会减少食欲。烤鸭色泽来自于烤制过程中的美拉德反应和焦糖化反应[1]。烤鸭在烤制过程中满足美拉德反应的一切条件，高温下羰基化合物和氨基化合物反应生成褐色物质。焦糖化反应在没有氨基化合物存在，加热到熔点以上糖脱水和降解的褐变反应。

色素的提取在植物和微生物方面研究较多，有关烤鸭颜色的相关研究鲜有报道[2-3]。为探究熏鸡糖熏上色机理，陆逢贵等[4]采用超声辅助提取糖熏鸡皮色素，为糖熏鸡皮色素的高效提取以及糖熏鸡颜色的研究提供相关理论依据。然而，关于色素组成及结构分析的报道较少，并且目前使用的分析方法主要是气相色谱法、分光光度法、核磁共振法、薄层层析法及毛细管电泳法[5]，这些传统的分析技术在色素的定性及结构分析上过程繁琐，误差大。高效液相色谱-串联质谱联用法是一种新的技术分析手段，用于复杂混合物的分析。高效液相色谱能够实现对复杂混合物的高分离，而质谱法的选择能力强、灵敏度高，能够提供物质的相对分子质量，两者相串联不仅实现了对复杂混合物更准确的定量和定性分析，还简化了样品的前处理过程，使分析更简便[6]。目前，以高效液相色谱-串联质谱联用技术进行的研究主要集中于医学的药物分析[7-8]、食品安全中有害成分的鉴别[9-10]等方面，对色素中复杂混合物的研究不多。孙妩娟等[11]采用高效液相色谱法对黑米色素进行分离，并对分离的组分进行结构鉴定，结果显示黑米色素中主要含有矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷[12]。这一研究结果为黑米色素的开发和利用做出了重要贡献。

因此，研究烤鸭色素的组成和结构，对于改善烤鸭皮的色泽品质具有重要意义。本研究从烤鸭皮中提取色素，使用紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱（Fouriertransform infrared spectroscopy，FT-IR）结合高效液相色谱-串联质谱法对其性质、组成和结构进行研究。以期为烤鸭颜色探究提供相关理论依据，为烤鸭工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻充气鸭坯（质量约2.0 kg） 宁波王绍菲食品有限公司；饴糖 浙江省宁波市鑫创糖业；乙醇、甲醇（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；溴化钾（分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

KN-24电热旋转式烤鸭炉 嘉兴艾博实业有限公司；CR-440色差仪 柯尼卡美能达办公系统（中国）有限公司；FRQ小型超声波清洗机 杭州法兰特超声波科技有限公司；RE-2000A旋转蒸发器 西安禾普生物科技有限公司；Allgra 64R冷冻离心机 上海普迪生物技术有限公司；UV-1601PC型紫外-可见分光光度计日本岛津公司；FI-IR5700型FT-IR仪 美国Nicolet公司；UPLC-Synapt G2液相色谱-质谱联用仪 美国Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烤鸭的制作[13]

解冻：室温条件下解冻18 只新鲜冻鸭坯，随机分为3 组，每组6 只。烫皮：沸水淋浇鸭皮。浇饴糖：将配制好的饴糖溶液（水和饴糖的比例为7∶1）均匀浇淋在鸭坯全身。晾坯：在一定的温度和湿度下，风干浇过饴糖的鸭坯表皮。烤制：设定相应的温度（200 ℃）和时间（40、60、80 min）将风干的鸭坯挂入电热旋转式烤鸭炉烤制。

1.3.2 样品的制备

随机选取烤制40、60 min和80 min的烤鸭，用手术刀将鸭胸处的膨化鸭皮取下，将烤鸭皮切成约2 cm×2 cm的小块，用锡箔纸包装，测定相关指标。真空包装剩余烤鸭在-40 ℃下贮藏，并在实验过程中取样。

1.3.3 烤鸭皮的感官评价

从农畜产品加工实验室选择20 位从事肉制品研究的研究生组成感官评价小组，按照Kerth等[14]的要求对感官评价小组成员进行培训，采用10 分制对烤鸭皮的颜色、外观、质构、风味、总体可接受性给出评分，具体评分参考刘欢等[15]的方法稍作修改。样品切成2 cm的薄片放入盘中，随机编号。评价员品尝一个样品之后用清水漱口，再进行另一个样品的评价，整个评价过程要求感官评价小组成员独立完成。

1.3.4 鸭皮色泽测定

烤制过程中鸭皮的色泽测定采用CIE的L*、a*、b*法。室温条件下使用D65光源，用色差仪对不同烤制时间鸭胸处鸭皮的L*（亮度）、a*（红度值）、b*（黄度值）进行测定，每个样品重复10 次，取平均值作为鸭皮的色度值。

1.3.5 烤鸭皮色素提取工艺

烤鸭皮（烤制60 min烤鸭的鸭皮）→预处理（去除多余的皮下脂肪）→剪碎→取样（2 g）→加乙醇→超声处理（20 ℃、400 W）→离心→过滤→色素提取液→测定吸光度（210 nm）。

1.3.6 色素的紫外-可见光谱分析

使用分光光度计在200～800 nm波长处对色素提取液进行光谱扫描，得到烤鸭皮色素的紫外-可见光光谱图。

1.3.7 FT-IR分析

色素经过超滤、冷冻干燥后与光谱级溴化钾粉末混合，然后研磨并压制成小球在5700型FT-IR仪上进行测定，波数范围4 000～400 cm-1。

1.3.8 高效液相色谱-串联质谱分析

液相色谱条件：C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱，见表1。样品质量浓度0.5 mg/mL；进样量10 μL；流速1.0 mL/min。

表1 液相色谱梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

质谱条件：电喷雾离子源，正离子灵敏度模式检测；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压30 V；萃取电压5.0 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂气体温度350 ℃。喷雾气为高纯氮气；碰撞气体为高纯氩气；反吹气体流速80 L/h；脱溶剂气体流速800 L/h。质谱扫描范围100～1 200 Da，扫描次数为0.3 s。校正曲线标准物质为甲酸钠。实时校正标准物质亮氨酸脑啡肽的m/z为556.277 1。

1.4 数据处理

采用SAS 8.0中One-way ANOVA的Duncan’s Multiple Range Test模型序进行统计学分析，P＜0.05，差异显著。每个实验重复3 次，数据结果表示为。采用Origin 9.1进行数据整理和作图。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

如图1所示，烤鸭皮的颜色感官评价值在4.90～9.00内变化，外观感官评价值为5.00～8.50，风味感官评价值在8附近上下波动，质构感官评价值为4.41～8.90，整体接受性在5.10～8.23内变化。烤鸭在高温烤制过程中发生褐变反应生成棕褐色物质，影响鸭皮色泽。不同烤制时间的烤鸭皮颜色差异显著（P＜0.05）。相比40 min和80 min的烤鸭皮，烤制60 min的烤鸭皮颜色评分最高。综合考虑外观、质构、风味和整体可接受性指标，选择烤制60 min的烤鸭皮作为色素提取样品。

图1 不同烤制时间烤鸭皮的感官特性Fig. 1 Sensory properties of roast duck skin with different roasting times

2.2 烤制时间对烤鸭皮色泽的影响

表2 不同烤制时间的鸭皮颜色参数Table 2 Color parameters of roast duck skin with different roasting times

由表2可知，烤鸭皮的L*值、a*值和b*值差异显著。在烤制过程中，随着烤制时间的延长，烤鸭皮亮度和黄度逐渐下降，红度逐渐上升。烤制40 min时，鸭皮亮度最高，a*值最低，产品呈现金黄色：烤制60 min时，鸭皮亮度较高，呈暗红色；烤制80 min时，鸭皮L*值最小，a*值较60 min的鸭皮小，呈现红棕色。随着烤制时间的延长，鸭皮上的还原糖与氨基化合物不断反应或单糖本身在高温下脱水和降解，鸭皮表面色泽从烤前的白色到金黄色，再到红色（包括亮红色和暗红色），随着反应的加剧，深褐色物质不断生成，鸭皮由暗红色变成棕色。所以要控制烤鸭的烤制时间，防止烤鸭皮变暗变黑。因此，结合感官评价的结果，选择烤制60 min的烤鸭皮作为色素提取的样品。

2.3 烤鸭皮色素的提取

色素的提取方法主要有浸提法和超声辅助提取法[16]。浸提法不仅费时费力，提取率还低，相比之下，超声辅助提取具备提取周期短、工序少、产率高的优点。因此采用超声辅助法对烤鸭皮色素进行提取。通过响应面优化试验得到烤鸭皮色素提取的最佳工艺参数[4]：最适宜提取液为乙醇，体积分数为60%，超声辅助提取时间30 min，液料比为10∶1（mL/g）。

2.4 烤鸭皮色素的紫外-可见光谱分析

图2 烤鸭皮色素的紫外-可见光谱图Fig. 2 UV-VIS spectrum of pigment from roast duck skin

如图2所示，色素的吸收范围约为200～400 nm，最大吸收波长为210 nm，270～280 nm处观察到典型的小吸收峰，吸收值向可见区（380～780 nm）减小。这一吸收特性与Kimura等[17]研究的黑色素的紫外-可见吸收光谱相似。此外，270～280 nm这一区域的小峰通常出现在天然黑色素的光谱中，这归因于与天然黑色素结合的蛋白质[18]。

2.5 烤鸭皮色素的FT-IR分析

图3 烤鸭皮色素的FT-IR图Fig. 3 FT-IR spectrum of pigment from roast duck skin

如图3所示，烤鸭皮色素的FT-IR在3 400 cm-1左右显示出一个宽而强烈的峰，用于羟基（—OH）或氨基（—NH2）的特征吸收。氢键的形成[19]或N—H的拉伸振动[20]使吸收峰波数下降且峰形变宽。2 925 cm-1和2 854 cm-1处的吸收峰是由C—H的拉伸振动形成的—CH和—CH2的共振吸收峰。1627 cm-1处的强吸收峰表明色素分子中存在C＝O[21]。1 454 cm-1处的吸收峰由—CH2CH3的弯曲振动引起。1 409 cm-1处的吸收峰是典型的甲基峰，也可能是C—N拉伸形成的[22]。C—O的拉伸振动在1 200～1 045 cm-1处形成峰值，而925 cm-1处出现峰值是COC对称拉伸的结果。在600～700 cm-1范围内的弱吸收峰表明，苯基上的氢原子被取代或者存在含有4 个以上的CH2基团的长链分子。此外，由C＝O和C＝C组成的共轭体系可以导致吸收峰向低频移动。C＝O、高共轭C＝C和长链化合物的存在表明，脂质氧化可能是烤鸭在烤制过程中鸭皮色素的形成原因之一。1 409 cm-1处的峰表明存在吡咯或吲哚NH基团[23-24]。1 380 cm-1处的吸收峰为特征甲基峰。C—CH3的弯曲振动在1 078 cm-1处形成峰值。色素的FT-IR光谱显示，其主要吸收带与先前研究的黑色素相似[25-26]。FT-IR光谱结果证明了CH3、CH2、C—O—H和C—O—C部分的存在。Yaylayan等[27]的研究表明，以葡萄糖醛酮或3-脱氧葡萄糖醛酮形式生成的呋喃糖，氧化后可形成羧酸衍生物，此外，1-脱氧葡萄糖也可以存在于呋喃糖中。羧酸衍生物和呋喃糖的聚合可以产生与FT-IR实验结果相似的结构。因此，可以推断烤鸭在烤制过程中鸭皮主要产生类似于蔗糖的呋喃类物质，表明存在糖苷连接的糖衍生物。以上结果表明，从烤鸭皮中分离出的色素是一种类似黑色素的色素。

2.6 烤鸭皮色素的鉴别

表3 烤鸭皮色素样品鉴别结果Table 3 Mass spectrometric parameters of pigments from roast duck skin

图4 烤鸭皮色素的高效液相色谱（A）和标准质谱（MS1）（B、C）Fig. 4 HPLC profile (A) and typical mass spectra (B, C) of pigment compounds from roast duck skin

图5 烤鸭皮色素中化合物的二次质谱Fig. 5 Tandem mass spectra of pigment compounds from roast duck skin

纯化后的色素用高效液相色谱-质谱联用仪进行分析，如表3、图4所示，色素的保留时间约为1.2 min（图4A）。色素在电喷雾离子源正负扫描模式下的标准质谱（MS1）如图4B、C所示，烤鸭皮色素是含有多种化合物的混合物。图4、5显示，在m/z365.11处获得了分子离子峰的最高强度（图5A），表明色素中存在相对分子质量为365.11的化合物（化合物1）。类似地m/z301.14处的分子离子峰（图5B），表明另一种化合物的相对分子质量为301.14（化合物2）。鸭皮色素中还含有相对分子质量分别为277.22（化合物3）、303.23（化合物4）、353.27（化合物5）和279.23（化合物6）的化合物。在化合物1中发现74的中性丢失（图5A），这表明它含有长链脂肪酸甲酯。该化合物可能是葡萄糖和果糖的低聚物，这与Sainz-Polo等[28]报道的结果一致。m/z301.14 [M＋H-17]＋（图5B）处的碎片离子峰表明化合物2中—OH的丢失。如图5C所示，化合物3中44的中性丢失可能由—CONH2的丢失引起，这意味着化合物3中存在酰胺基，可归因为美拉德反应。化合物4中也有44（—CONH2）的中性丢失（图5D）。m/z303.23 [M＋H-18]＋处的碎片离子峰表明，化合物4可能含有—OH或—CHO基团，其中通过消除反应很容易失去水分子。Kim等[29]研究蔗糖、葡萄糖和果糖的Van Krevelen图发现，由于H/C值较高，O/C值较低，氧化还原反应中形成的一系列小化合物处于脱水线以上，其生成过程除了涉及脱水反应，可能还发生脱氢、脱甲基等反应。Limacher等[30]研究美拉德反应中呋喃的形成提出了类似的氧化还原产物。这些化合物可能来源于脂肪氧化和焦糖化反应。如图5E所示，化合物5中—OH的损失在m/z[M＋H-17]＋处产生碎片离子峰。如图5F所示，化合物6显示了—CHO基团的损失，通过消除反应很容易损失一个水分子。

总的来说，质谱结果表明鸭皮色素由多个化学成分组成，包括长链脂肪酸酯、齐聚物、氧化还原反应产物和脂质氧化产生的衍生物。棕色色素中酰胺和醛的存在可能是美拉德反应的结果。然而，这些数据不足以确定这些化合物的分子结构。可进一步对烤鸭皮色素组分作定性、定量分析，通过与标准品对照，探究影响烤鸭皮颜色的主要物质。

3 结 论

采用紫外-可见光谱、FT-IR和高效液相色谱-串联质谱法对超声提取的烤鸭皮色素的组成和结构进行分析。结果表明色素中含有长链化合物和官能团为—OH、C＝O、—NH2和高共轭C＝C的化合物。烤鸭皮色素由长链脂肪酸酯、齐聚物、氧化还原反应产物、脂肪氧化产生的衍生物以及酰胺和醛类等多种化学成分组成。色素的主要来源是美拉德反应的中间产物、焦糖化的热降解和反应过程中化合物的聚合。随着烤鸭烤制时间的延长，烤鸭皮色泽L*值逐渐下降，a*值和b*值上升。烤鸭皮颜色品质主要受美拉德反应速率和焦糖化反应速率的影响，因此，在烤鸭烤制过程中，通过控制烤制温度和烤制时间可以优化烤鸭皮的颜色，进而提高烤鸭品质。然而色素中化学成分的复杂性表明，烤鸭皮的褐变也可能是多种反应相互作用的结果。因此，对烤鸭皮色素的实际形成机理还需进一步研究。