微流控芯片在人类精子优选中的应用*

曹思原 陆金春 靖 俊 薛同敏 张光云 曾 嵘 姚 兵**

1. 南京师范大学生命科学学院（江苏南京210023）；

2. 东南大学附属中大医院生殖医学中心（江苏南京210037）；

3. 东部战区总医院生殖医学中心（江苏南京210002）

近年来，男性不育患者增多，人们对辅助生殖技术的需求量有所增加[1]。 在辅助生殖技术中，从精液样本中优选出足够数量的高质量精子是辅助生殖技术成功的关键步骤之一。 目前，临床上常规使用的精子优选方法为上游法和密度梯度离心法， 它们均能提高优选后的精子活力，并回收一定数量的精子。 然而，无论上游法还是密度梯度离心法， 其操作过程繁琐且均涉及机械力操作，这可能会导致精子中的氧自由基水平升高，增加DNA 损伤，降低精子质量[2]。 因此，临床上迫切需要一种更有效的精子优选方法。 上世纪九十年代初，微流控技术正式诞生， 它是建立在几平方厘米芯片上的生物或化学实验室， 将实验中各种零散操作整合在芯片中完成，缩短了实验时间，提升了实验灵敏度，节约了实验成本[3]。此后，其在精子优选中的应用逐渐被广泛研究[4]。 Nosrati 等[5]设计的微流控芯片优选人类精子后，其精子DNA 完整性显著提升，且优选效率高。 Parrella等[6]设计的微流控芯片优选人类精子后，其精子活力与正常形态精子百分率较密度梯度离心法显著提高，DNA 损伤率较密度梯度离心法显著降低。Nakao 等[7]设计的微流控芯片优选小鼠精子后其精子活力、顶体完整性以及受精率均显著升高。 然而，绝大部分微流控芯片设计、制作复杂，原料成本过高，不利于大批量生产应用。 本研究自行设制一种灵巧简便、成本低廉的微流控芯片装置优选精子，并将优选后的精子活力、浓度、DFI与上游法和密度梯度离心法进行比较。

材料与方法

一、实验对象

精液样本源自我院生殖医学中心的男性不育患者， 患者禁欲2～7 d 后手淫取出精液置于无菌采集器中，于37℃恒温水温箱中液化1h。 本研究经我院伦理委员会批准，并获患者知情同意。

二、试剂与仪器

人输卵管液培养液（HTF）、密度梯度离心液购于美国SAGE 公司， 精子核完整性检测试剂盒购于南京欣迪生物药业工程有限责任公司。

CASA 系统购于北京伟力公司，流式细胞仪购于美国BD 公司。

三、微流控芯片

由本团队陆金春博士自行设计 （专利申请号：201910465724.6）， 以 聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯（polymethyl methacrylate，PMMA）为制作材料。 装置内部由环形薄壁分为内外两圈，外侧圈中可加入精液样本（不漫过薄壁最高处），内侧圈中加入HTF 直至漫出薄壁进入外圈层，与精液形成分层，整个液面略高于薄壁，质量好的精子具有贴壁游动的特性， 可先贴薄壁外侧游动至HTF 上层，再贴薄壁内层游入内圈层中，从而达到浓缩和筛选优质精子的目的。

四、微流控芯片的安全性研究

每份精液各取300μL分别置于芯片内圈中和无毒灭菌离心管中室温放置， 每组在1h、2h、3h、4h 时各吸取5μl 精液，测其精子活力。

五、微流控芯片优选精子不同时间的效果比较

取1ml 精液样本加入芯片外圈中，静置5min 后在芯片内圈中缓缓加入480μLHTF，使其漫过内圈最上方并与外圈中精液形成分层，37℃、5%CO2培养箱中静置， 分别在40min、60min、80min 时吸取内圈中5μl 混匀的HTF，测其精子活力与浓度。

六、三种不同方法优选精子的比较

分别用微流控芯片法、 上游法和密度梯度离心法优选精子。

微流控芯片法：同“五、微流控芯片优选精子不同时间的效果比较”， 最后回收的HTF 补足至500μl，并测其精子活力、浓度与DFI。

上游法：于无毒灭菌离心管中加入1mL精液，300×g离心5min，弃上清后加入500μl HTF 重悬沉淀，在上方缓缓加入1mL HTF 形成分层， 离心管45°倾斜置于37℃、5%CO2培养箱中上游1h， 回收最上方500μL HTF，测其精子活力、浓度与DFI。

密度梯度离心法： 于无毒灭菌离心管中依次加入80%、40%密度梯度离心液，将1ml 精液样本缓缓加入离心液上层，300×g 离心20min，弃上清后加入2mL精子洗涤液重悬沉淀，200×g 离心5 min， 弃上清后加入500μL精子洗涤液重悬沉淀，测其精子活力、浓度与DFI。

七、精子各参数测定

精子活力与浓度检测：参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版，用CASA 系统检测。

精子DFI 检测： 参照精子核完整性检测试剂盒说明书操作，用吖啶橙对精子进行染色，染色后的精子悬液通过流式细胞仪检测其DFI。

八、统计学分析

用SPSS17.0 分析数据， 差异性比较前对数据进行正态分布检测，若每组数据均符合正态分布，用±s 表示计量资料，若有数据不符合正态分布，则用M（QR）表示计量资料。 除微流控芯片法与上游法、微流控芯片法与密度梯度离心法优选前后各精子参数进行组间比较时使用Mann-Whitney U 检验外，其余均用Wilcoxon 符号秩检验进行组间比较，P＜0.05 为有统计学意义的差异。

结 果

一、微流控芯片的安全性研究

无毒灭菌离心管和微流控芯片中精子活动率与前向运动精子百分率在各个时间段均无显著性差异（P＞0.05）（表1），提示微流控芯片对精子无毒害作用。

表1 不同时间点两组中精子活力比较[n=30，M（QR）]

二、微流控芯片优选精子不同时间的效果比较

与优选前相比， 微流控芯片优选40min、60min 和80min 后的精子活动率与前向运动精子百分率均显著升高（P＜0.01），精子浓度则显著降低（P＜0.01）；40min、60min 和80min 三组之间优选后的精子活动率与前向运动精子百分率无显著性差异（P＞0.05）；与40min 组相比，60min 组与80min 组优选后的精子浓度均显著升高（P＜0.05），60min 组与80min 组的精子浓度则无显著性差异（P＞0.05）（表2）。 提示60min 为微流控优选精子的最佳时间。

表2 微流控芯片优选不同时间后各精子参数的比较[n=10，M（QR）]

三、三种不同精子优选方法的效果比较

三种方法优选前各精子参数均无显著性差异（P＞0.05）。 较优选前，三种方法优选后的精子活动率与前向运动精子百分率均显著升高（P＜0.01），微流控芯片与上游法优选后的精子浓度显著降低（P＜0.01），密度梯度离心法优选后的精子浓度没有差异；与优选前相比，微流控芯片优选后的精子DFI 无显著性差异（P＞0.05），上游法与密度梯度离心法优选后的精子DFI 显著升高（P＜0.01）；与上游法与密度梯度离心法相比，微流控芯片优选后的精子活动率与前向运动精子百分率均显著升高（P＜0.01），而精子浓度与DFI 则显著降低（P＜0.05）（表3）。

讨 论

据WHO 报道，不孕不育发病率高达10%～15%，而男性因素则约占一半[8]。 随着辅助生殖技术的发展，越来越多不孕不育家庭借此技术得到幸福。 然而，当前辅助生殖成功率只有约三分之一[9]。 目前应用于临床的辅助生殖技术包括人工授精（artificial insemination，AI）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）以及卵胞浆内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），无论哪种技术，都需要先对精子进行优选，提升优选后的精子质量将成为提升受精成功率的关键[10]。

表3 三种方法优选前后各精子参数比较[n=20，M（QR）]

本研究中我们自制PMMA 微流控芯片对精子进行优选。 PMMA 俗称有机玻璃，其光学特性好、稳定性强、耐腐蚀、易成型，经常应用于各种工艺品以及生物医学检验芯片的制作[11,12]。 本研究所设计的微流控芯片采用有机玻璃为原料，通过安全性研究实验证明，与无毒灭菌离心管类似，其对精子无毒害，适合在微流控芯片生产中使用。

长期以来， 精子活力与浓度都是临床上评价精子质量的重要指标。 微流控芯片优选后的精子活动率与前向运动精子百分率均优于上游法与密度梯度离心法，这可能是因为与这两种方法相比，微流控芯片优选精子过程中避免了样本的多次转移， 减少了操作过程中对精子造成的致命损伤。 但是，微流控芯片优选后的精子浓度远远低于这两种方法， 可能是因为贴壁游动对精子要求高， 这样的结果不利于优选精子后的宫腔内人工授精（IUI）过程，尤其是少精子症患者。

随着辅助生殖技术的发展， 人们也逐渐开始从微观水平分析精子质量，精子DNA 完整性近年来成为关注热点。 精子活力、浓度等仅是从高活力精子产生数量方面分析精子，并不能准确预测其生育能力，一次成功的受精依赖于精子中高完整性的DNA 分子。 有研究表明，精子DNA 片段化高与受精率低相关[13]。 微流控芯片优选后的精子DFI 低于上游法与密度梯度离心法，这可能是因为微流控芯片在优选过程中无需离心，避免了其对精子带来的机械损伤与氧化应激。

综上所述，与传统精液分选方法相比，本研究所设计的微流控芯片操作简便，价格低廉，能优选出质量更高的精子；尽管在某些方面仍需改善，但其在辅助生殖技术中尤其是在IVF/ICSI 技术中已显示出良好的应用前景。