中药材毛茛和扬子毛茛的薄层色谱鉴别方法考察

熊 敏，杨 鑫，吴兰云

(贵州省黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 黔东南州 556000)

本品为毛茛科植物毛茛RanunculusjaponicusThunb.或扬子毛茛RanunculussieboldiiMiq.的新鲜或干燥全草。夏、秋二季采集，鲜用或洗净沸水烫过，切段晒干。本品亦为我省少数民族用药。最早记载于《本草拾遗》，毛茛为贵州省少数民族用药，收载在《贵州草药》 (第一集)1970年7月第1版，书中描述毛茛为毛茛科毛茛RanunculusjaponicusThunb.的全草。民间苗医用药中习以新鲜全草或干燥全草入药，口口相传，广为使用。毛茛科Ranunculaceae植物多为草本[1]，由多种化学药物组成，在我国有30属约220种植物可供药用，全草为外用发泡药，治疟疾、黄疸病；鲜根捣烂敷患处可治淋巴结核；也可作土农药。全草含毛茛苷，鲜根含原白头翁素(Protoanemonin，C5H4O2)0.12%，在干燥过程中，易发生分子重合反应而变成无刺激性的结晶白头翁素(anemonin，C10H8O4)[2]，为有毒植物。全草含原白头翁素(Protoanemonin，C5H4O2)及其二聚物白头翁素(anemonin)，新鲜植物含白头翁素0.05%。

毛莨(《本草拾遗》)[3][异名]水茛、毛建(《肘后方》)，毛建草、猴蒜(《本草拾遗》)，天灸(《梦溪笔谈》)，毛董、自灸(《纲目》)，鹤膝草、瞌睡草、老虎草、犬脚迹、老虎脚迹草、火筒青(《中国药植志》)，野芹菜(《福建民间草药》)，辣子草、辣辣草(《民间常草药汇编》)，毛芹菜、老虎须(《江西民间草药》)，千里光、老鼠脚底板、烂肺草(《中药植物图鉴》)，三脚虎、水芹菜(《泉州本草》)，扑地棕、翳子药、一包针(《贵中草药》)，鱼疔草、鸭脚板、野芹菜、山辣椒、老虎脚爪草、毛芹菜、起泡草(《全国中草药汇编》)。《全国中草药汇编》[4]中对扬子毛茛的别名有：辣子草、水辣菜。东北至华南以及长江中下游各省，全国大部分地区均有分布，我省各地均产。毛茛作为地方民间用药研究甚少，尤其对于其质量标准，缺少相关科学文献。

1 仪器

仪器：1)卡玛LINOMATAT5半自动点样器；2)KQ - 500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

薄层板：1)青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号20160208)；2)青岛胜海精细化工硅胶有限公司G板(批号：20171212)；3)青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号：20170811)；4)默克化工技术(上海)有限公司硅胶G板(批号HC41642055)。

试剂：环己烷、乙酸乙酯均为分析纯。

药材：所有实验样品均由本中心课题组采样组的人采集，同批压制标本经孙庆文教授鉴定，鉴定为毛茛科植物毛茛：RanunculusjaponicusThunb.或扬子毛茛RanunculussieboldiiMiq.。鉴定结果及样品来源见表1。

表1 供试样品来源表Tab.1 Sources of test samples

2 方法与讨论

2.1 供试品溶液的制备

分别取毛茛和扬子毛茛1 g，分别加入提取溶剂25 mL，分别超声处理30 min后，滤过，滤液蒸干，残渣加相应的提取溶剂1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.2 对照药材溶液的制备

原标准无薄层鉴别项，根据文献调研毛茛和扬子毛茛所含成分主要是原白头翁素，而原白头翁素热稳定性较差，易转变为白头翁素，而原白头翁素和白头翁素市场无对照品可售，故采用自身对照药材为对照。

2.3 薄层层析

按照2015版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法进行试验，称取三棵树毛茛2份各1 g，分别超声30 min和回流1 h，称取青岩扬子毛茛2份各1 g，分别超声30 min和回流1 h，以95%乙醇为提取溶剂。滤过，滤液蒸干，残渣分别加95%乙醇各1 mL使溶解，分别取5 μL点于同一硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号20160208))上，以环己烷∶乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，分别置自然光(日光)、碘蒸气熏10 min和紫外光(365 nm)等条件下检视。结果自然光下斑点不太清晰(见图1)，不建议在日光下观察斑点；碘蒸气熏所有斑点较为清晰(见图2)，可用碘蒸气熏至斑点清晰后检视；紫外光(365 nm)下斑点清晰(见图3)，紫外光(365 nm)下和碘蒸气熏比较，碘蒸气有一定的毒性，且在紫外光(365 nm)下检视更为清晰，建议使用紫外光(365 nm)下检视。

图1 日光灯下检视 图2 熏蒸后检视 Fig.1 View under Fig.2 View after fumigation fluorescent lamp

图3 紫外灯下检视Fig.3 View under ultraviolet lamp

2.4 毛茛和扬子毛茛的不同提取溶剂考察

按照2015版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法进行试验，分别称取毛茛和扬子毛茛1 g，分别以不同浓度甲醇和乙醇为提取溶剂，超声处理30 min。滤过，滤液蒸干，残渣分别加甲醇、乙醇各1 mL使溶解，分别取5 μL作为供试品溶液。吸取上述供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号20160208))上，以环己烷∶乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光(365 nm)下检视。结果提取溶剂A：用甲醇与95%乙醇，提取斑点颜色无明显差异，因为乙醇比甲醇较经济，无毒性，故建议用乙醇作为提取溶剂，见图4；提取溶剂B：用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取毛茛。结果25%乙醇、50%乙醇提取出来的斑点均不清晰，而75%乙醇与95%乙醇斑点均清晰，建议用95%乙醇提取方便，不用配制，直接取用，较为省时和简便，见图5；提取溶剂B：用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取扬子毛茛，结果25%乙醇与50%乙醇的斑点不清晰，而75%乙醇与95%乙醇斑点均清晰，建议用95%乙醇提取方便，不用配制，见图6。故建议优选乙醇为提取溶剂。

图4 提取溶剂A (1、3扬子毛茛和2、4毛茛)Fig.4 Extraction solvent A (1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

图5 提取溶剂B(毛茛) 图6 提取溶剂B(扬子毛茛) Fig.5 Extraction solvent B Fig.6 Extraction solvent B(Ranunculus japonicus) (Ranunculus sieboldii)

2.5 毛茛和扬子毛茛不同温湿度的考察

按照 2015版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法进行试验，分别称取毛茛和扬子毛茛各1 g，用95%乙醇提取，超声30 min后，滤过，滤液蒸干，残渣分别加乙醇各1 mL使溶解，吸取上述供试品溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号20160208))上，使用展开剂(环己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展开，置于紫外光(365 nm)下检视薄层色谱图。结果温湿度a：低温7 ℃与较高湿70%条件下，供试品分离度较好，见图7；温湿度b：低温15 ℃与较高湿85%条件下，供试品分离度较好，见图8；温湿度c：中温20 ℃与较高湿58%条件下，供试品分离度较好，见图9；温湿度d：较高温30 ℃与较高湿72%条件下，供试品分离度较好，见图10；温湿度e：较高温35 ℃与较低湿35%条件下，供试品分离度较好，见图11。

图7 温湿度a(1、3扬子毛茛和2、4毛茛)Fig.7 Temperature and humidity a(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

图8 温湿度b(1、3扬子毛茛和2、4毛茛)Fig.8 Temperature and humidity b(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

图9 温湿度c(1、2毛茛和3、4扬子毛茛)Fig.9 Temperature and humidity c(1，2：Ranunculus japonicus；3，4：Ranunculus sieboldii)

图10 温湿度d(1、2毛茛和3、4扬子毛茛)Fig.10 Temperature and humidity d(1，2：Ranunculus japonicus；3，4：Ranunculus sieboldii)

图11 温湿度e (1、3扬子毛茛和2、4毛茛) Fig.11 Temperature and humidity e(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

2.6 毛茛与扬子毛茛不同产地和不同薄层板生产厂家考察

图12 青岛胜海Fig.12 Qingdao Shenghai

按照2015版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法进行试验，分别称取毛茛和扬子毛茛各1 g，样品来源分别为：1毛茛(余庆县城关20180426)、2毛茛(施秉县城关20180427)、3毛茛(凯里三棵树20180516)、4毛茛(对照药材)、5扬子毛茛(贵阳市青岩镇20170505)、6扬子毛茛(荔波县佳荣镇)、7扬子毛茛(开发区瓮义20170518)、8扬子毛茛(对照药材)，在温度16 ℃，湿度80%条件下，用95%乙醇提取，超声30 min后，滤过，滤液蒸干，残渣分别加95%乙醇各1 mL使溶解，吸取上述供试品溶液各5 μL，分别点于3个不同生产厂家薄层板上，使用展开剂(环己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展开，置于紫外光(365 nm)下检视薄层色谱图，结果点于硅薄层板(青岛胜海精细化工硅胶有限公司G板，批号：20171212)上的斑点清晰，见图12；点于青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号：20170811)上的斑点清晰，见图13；点于默克化工技术(上海)有限公司硅胶G板(批号HC41642055)上的斑点清晰，见图14。

图13 青岛海洋 图14 默克化工Fig.13 Qingdao Ocean Fig.14 Merck Chemical

2.7 稳定性实验

按照 2015版《中国药典》四部通则0502薄层色谱法进行试验，分别称取毛茛和扬子毛茛各1 g，样品来源：1毛茛(余庆县城关20180426)、2毛茛(施秉县城关20180427)、3毛茛(凯里三棵树20180516)、4毛茛(对照药材)、5空白对照、6扬子毛茛(贵阳市青岩镇20170505)、7扬子毛茛(荔波县佳荣镇)、8扬子毛茛(开发区瓮义20170518)、9扬子毛茛对照药材，在温度8 ℃湿度82%条件下；用95%乙醇提取，超声30 min后，滤过，滤液蒸干，残渣分别加95%乙醇各1 mL使溶解，分别吸取上述供试品溶液各5 μL点于任意选取两个厂家硅胶G薄层板上，使用展开剂(环己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展开，置于紫外光(365 nm)下检视薄层色谱图，结果供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。结果表明，分离度好，斑点显色清晰，见图15、图16。故建议选择将此项列入质量标准正文。

图15 青岛胜海 图16 青岛海洋Fig.15 Qingdao Shenghai Fig.16 Qingdao Ocean

3 结果

1)此次试验分别置于自然光(日光)、碘蒸气熏10 min和紫外光(365 nm)等条件下检视，结果自然光下斑点不太清晰，不建议在日光下观察斑点，碘蒸气熏所有斑点较为清晰，可用碘蒸气熏至斑点清晰后检视，紫外光(365 nm)下斑点清晰，紫外光(365

nm)下和碘蒸气熏比较，碘蒸气有一定的毒性，且在紫外光(365 nm)下检视更为清晰，建议使用紫外光(365 nm)下检视。

2)提取溶剂的考察

提取溶剂分别是：提取溶剂A(甲醇与乙醇)、提取溶剂B(25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇)，两种提取溶剂对毛茛和扬子毛茛进行考察，结果提取溶剂A分别提取毛茛和扬子毛茛，斑点颜色均无明显差异，因为乙醇比甲醇较经济，无毒性，故建议用乙醇作为提取溶剂；用提取溶剂B提取毛茛和扬子毛茛，结果25%乙醇、50%乙醇提取出来的斑点均不清晰，而75%乙醇与95%乙醇的斑点均清晰，建议用95%乙醇提取方便，不用配制，直接取用，较为省时和简便，故建议优选乙醇为提取溶剂。

3)温湿度的考察

分别是：温湿度a：低温7 ℃与较高湿70%；温湿度b：低温15 ℃与较高湿85%；温湿度c：中温20 ℃与较高湿58%；温湿度d：较高温30 ℃与较高湿72%；温湿度e：较高温35 ℃与较低湿35%。5种温湿度进行考察，结果供试品分离度都较好。

4)产地和薄层板生产厂家的考察

分别吸取3个不同产地的毛茛和扬子毛茛点于3个不同生产厂家的硅胶G板上(青岛胜海精细化工硅胶有限公司G板(批号：20171212)、青岛海洋化工厂分厂硅胶G板(批号：20170811)和默克化工技术(上海)有限公司硅胶G板(批号HC41642055))，结果斑点都较清晰。

5)稳定性实验考察

分别吸取3个不同产地的毛茛、扬子毛茛、空白对照和自身对照药材点于任意两个不同生产厂家的硅胶G板上，结果供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。结果表明：该方法色谱斑点清晰，易于检出，重现性好，可准确有效地鉴别出中药材毛茛和扬子毛茛，故建议选择将此项列入质量标准正文。