脂肪基质血管组分促进膝骨关节炎软骨修复的研究进展

杨锦荧，楼袁美，单乐天，周莉（★通信作者)

（1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学第四临床医学院，浙江 杭州 310053；3.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053）

0 引言

膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是临床上一种常见的退行性疾病，主要是肥胖、劳损、创伤等多种因素引起的关节软骨破坏、关节边缘和软骨下骨反应性增生。本病累及膝关节，常见的临床表现为缓慢发展的关节性疼痛、关节肿胀僵硬和关节畸形等。有调查研究表明，40%左右的男性和47%左右的女性一生都受此病影响，给个人和社会经济都产生了极大压力。

为减缓KOA进展，干预KOA病理过程十分必要。目前用于临床治疗KOA的方法主要有物理、药物、手术三种疗法。物理疗法标准不统一，治疗效果相当有限；药物治疗通常使用非甾体抗炎药（NSAID）、透明质酸（HA）、类固醇等药物，但至今无一种传统药物可使KOA患者完全康复，且NSAID易在关节处累积，对人体造成伤害；手术治疗通常是全膝关节置换术（TKR），其成本很高，且会产生多种并发症，增加感染、心血管疾病、呼吸系统并发症、恶性肿瘤的发病率甚至死亡率。在众多治疗KOA的可能中，新兴的再生医学给KOA的治疗提供了一个好方向，越来越受人们的关注。其中脂肪源性基质血管分数（Stromal Vascular Fraction,SVF）凭借其天然、污染少、安全性高、再生能力强、药效时间长、合并症少、可塑性强，相比较于传统KOA治疗疗效优良且价格低廉的优点在最新研究中已被证实是临床应用治疗KOA的最好药物治疗手段之一[1]。

1 SVF

SVF是从脂肪组织中去除成熟脂肪细胞后剩余的的水相组分，含有多种具有修复功能的细胞以及细胞因子混合物形成的细胞群,包括脂肪源性干细胞（ADSCs）、内皮祖细胞（EPCs）、内皮细胞（ECs）、巨噬细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、周细胞、造血干细胞和脂肪前体细胞等。其中，ADSCs是SVF的重要组成部分，ADSCs具有多向分化潜能，有较强的血管再生能力、免疫调节能力和抗炎能力，其在成骨或软骨形成方面的潜能已得到充分的证实和广泛的研究[2]。就SVF的再生作用而言，主要是ADSCs与EPCs之间的相互作用。SVF主要通过酶消化法和机械乳化法获取。酶消化法是将抽脂获得的脂肪组织使用蛋白酶消化，破坏细胞外基质中的胶原纤维，获得含多种细胞的基质液，再通过离心或者是滤过静置获得最下层沉淀，该沉淀即为SVF。机械乳化法是将1mm孔抽脂针所抽到的微小颗粒经注射器快速对打30次，该过程使脂肪中的成熟脂肪细胞被破坏，再将所得的脂肪乳化液过滤即可获得纳米脂肪（Nanofat）。Nanofat与SVF的成分基本一致，但多了死亡的脂肪细胞碎片。与酶消化法相比，机械乳化法可节约时间和成本，但死亡的脂肪细胞碎片会引起局部炎症反应，为改善机械乳化法的炎症反应，近年来多项改良机械乳化法被提出。

2 SVF治疗骨关节炎的临床前研究

2.1 手术诱发KOA模型

Xiaoteng Lv等人[3]使用双边前交叉韧带横断（ACLT）和内侧半月板切除（MM）建立KOA模型的雄性小尾寒羊，通过磁共振成像（MRI）评分，微型计算机断层扫描（μCT）检测等方法分析显示SVF+HA治疗后软骨质量良好，SVF+HA治疗能增强滑液中sdf-1的表达，SVF+HA治疗后软骨修复组织的磁共振成像评分（Mocart）和国际软骨评分学 会的评分（ICR）评分显著提高。使用成年雄性新西兰兔通过ACLT诱导KOA，ASCs组在16周时，显示组织良好的组织，Laverty评分低，与KOA组相比软骨厚度增加，减缓KOA进展并且在治疗的动物中发挥治愈作用，说明ASCs具有促进软骨和半月板修复的治愈能力以及减少治疗过程中滑膜炎症事件的作用[4]。另外在一个评估体内KOA模型中通过关节内途径递送至膝关节的扩展ASCs、SVF和微碎脂肪组织（MFAT）的迁移模式的实验中[5]，成年雄性新西兰兔用ACLT在八周时诱导了轻度KOA。在膝关节内注射SVF后发现，SVF对滑膜和半月板表现出更高的趋向性，而软骨在第7天表现出最低的细胞百分比，特别是与软骨相比，在滑膜中检测到SVF迁移细胞的比率更高，具有多种软骨保护作用。在手术诱发的KOA大鼠模型中，使用逆转录病毒用SOX三基因转导大鼠腹股沟脂肪分离的ASCs，培养后注射到通过手术诱导的KOA大鼠膝关节中。结果显示与SOX三联体共转导的ASCs显著促进了SOX骨软骨缺损模型中的体内软骨愈合，并防止了手术诱导的KOA退行性变化的进展[6]。也有使用阉割的雄性西部交叉山羊,通过ACLT和MM单侧诱导供体动物膝关节中的KOA，在间充质干细胞（MSCs）处理的关节中，表明内侧半月板显著再生，并且在新形成的组织中检测到植入的细胞。与没有细胞的载体处理的关节相比，细胞处理的关节中关节软骨骨赘重塑和软骨下硬化的退化减少。将成人MSCs局部递送至受损关节刺激半月板组织的再生并延缓通常在该KOA模型中看到进行性破坏[7]。

2.2 原发型KOA模型和胶原酶关节内注射诱导KOA模型

有研究使用关节软骨损伤的NOD/SCID小鼠模型，对治疗组注射SVF和富含血小板的血浆（PRP）。在治疗组中，与对照相比，后肢受伤的小鼠表现出在桌子上移动所需的时间减少。根据受损软骨的面积（%），新软骨的面积（%）和新软骨细胞层的数量的参数比较，治疗组的软骨再生能力明显大于对照组，说明SVF和PRP的组合效应对小鼠模型中软骨的增殖、分化和再生的刺激具有积极作用，这些结果证明SVF联合PRP移植是治疗关节软骨损伤的有效方法[8]。Ter Huurne等人[9]通过将胶原酶注射到C57BL/6小鼠的膝关节中诱导实验KOA，在胶原酶诱导KOA后7天，将ASCs注射到小鼠的膝关节中。与对照相比，ASCs移植小鼠的膝关节软骨损伤水平在42天后降低了近50%，具体而言，治疗小鼠的膝关节损伤降至25%，而对照组为88%。早期胶原酶诱导的KOA向小鼠膝关节单次注射ASCs可抑制滑膜增厚、与韧带相关的内生菌的形成和软骨破坏。

3 SVF治疗骨关节炎的临床应用研究

在一项前瞻性研究中，Damir Hudetz[10]等将微碎片脂肪抽吸物（MLA）注射到20例原发性晚期膝骨关节炎（KOA）患者中，并从MLA样品获得的SVF细胞用于对细胞表面标志物特异的抗体染色。结果表示膝关节损伤和骨关节炎结果评分（KOOS）、西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）、视觉模拟评分（VAS）与基线相比，患者都有显著和普遍的改善，且无不良事件（AE）。其研究证实，MLA富含具有高再生能力的SVF细胞。在一项临床试验中，Yokota N[11]等比较ASCs治疗42例患者（59膝）和SVF治疗OA患者38例（69膝），用VAS、KOOS作为评分标准，风湿病学中的结果测量-国际骨关节炎研究学会（OMERACT-OARS）标准用于评估阳性反应。最后结果表明ASCs和SVF均可改善KOA患者的临床症状，且两组均未发生严重并发症，但ASCs在症状和疼痛早期减轻时的表现优于SVF。在Russo A[12]研究治疗骨关节炎时，使用了微碎片脂肪组织，因为它的SVF细胞具有抗炎和再生特性。其中22例患者注射微碎片脂肪组织，且在3年内无接受其他治疗。结果显示，患者的KOOS、VAS、国际IKDC评分、Tegner、Lysholm膝关节评分量表在一年随访中有所改善。Jaroslav Michalek等[13]对29例年龄在80-94岁的KOA患者注射从脂肪组织中分离的SVF细胞进行治疗，36个月对所有5个参数的复杂评分评估（疼痛，每周镇痛药/ NSAIDs数量，行走时跛，关节僵硬和关节活动的程度）进行分析。结果表明，与SVF治疗前的状态相比，SVF治疗后36个月观察到显著且持续的评分改善，且没有发现手术后长期副作用或并发症。Bora Bright等[14]的一项研究中，使用自体脂肪来源的SVF治疗一名27岁的澳大利亚女性OA和强制性脊柱炎，还伴有慢性疼痛综合征和创伤后应激障碍等多种合并症。通过磁共振成像评估（WORMS）、WOMAC和髋关节残疾和OA结果评分。在用标准化SVF治疗她的臀部和膝盖的OA之后，在第3、6个月和第三年对臀部和KOA结果评分，测量其功能状况。结果表明，患者不仅减少了OA症状，随着膝盖和臀部的改善，她的其他合并症如强制性脊柱炎、抑郁、焦虑和疲劳表现出明显的改善，这些发现提示了SVF的治疗效果。Himanshu Bansal等[15]发现使用酶将10名患者腹部移除的脂肪组织消化分离得到SVF并重悬于PRP中，可提高治疗效果，结果表示患者疼痛水平降低，且该治疗方法的安全性极高，无不良事件。Gibbs N[16]等研究了四名KOA患者，将运动康复计划与关节内注射自体StroMed（即通过脂肪抽吸物超声空化浓缩的SVF）和PRP结合。结果表示，当StroMed细胞疗法与传统的运动实践和PRP结合治疗骨关节炎时，可减轻患者的疼痛，提高患者的生活质量。Hong Z等[17]研究比较自体脂肪来源的SVF与HA对16名双侧症状KOA患者，随机分为两组，患者膝关节一侧注射SVF，另一侧注射等量HA。结果显示，与HA处理的膝关节相比，SVF处理的膝关节软骨修复得到显著的改善。说明自体脂肪来源的SVF治疗是安全的且可有效缓解KOA患者的疼痛，改善功能和修复软骨缺损。在另一项研究比较中，Phu Dinh Nguyen[18]对15例患有KOA患者进行关节镜微骨折术（AM）和注射重悬于PRP的SVF治疗，与仅接受AM治疗的15例安慰剂组患者相比，所有治疗组的疼痛和WOMAC评分显著降低，Lysholm膝关节评分和VAS评分增加，表明SVF/PRP注射治疗有效改善了OA。

表1 SVF治疗KOA的临床研究总结

4 SVF作用机制研究

SVF在再生医学和膝骨关节炎的治疗中发挥着重要作用，一般来说，SVF被认为通过多种机制再生组织。脂肪组织分解释放出许多类型的细胞，这些细胞共同被称为SVF。SVF中的细胞可以产生几种可溶性生物活性因子。其中，ADSCs（脂肪来源的基质细胞）和EPCs（内皮前体细胞）是SVF的两个重要组成部分，它们分别通过VEGF（血管内皮生长因子）和PDGF-BB（血小板衍生生长因子）的协同作用，以实现细胞增殖，归巢至损伤部位、新血管形成等[19]，因此，ADSCs和EPCs有对血管生成的潜在作用。KOH和他的同事已经证明SVF促进新生血管不是通过血管的生成，而是通过其内皮细胞重新组装预先存在的血管[20]。另外，SVF还有大家基本认可的抗炎作用，SVF含有单核细胞和巨噬细胞，在SVF中发现的的巨噬细胞表达M2表型，这些巨噬细胞介导炎症反应。M2细胞被认为发挥抗炎作用，可以抑制炎性细胞的募集，因此为炎症提供了新的治疗机会[21]。

重要的是，SVF在骨关节炎中的研究里，OA患者的关节软骨由于多种细胞因子的存在而发生分解代谢反应，这些细胞因子可能来自滑膜或软骨细胞。这些炎性细胞因子负责蛋白酶的产生和蛋白聚糖产生的下调[22]。在SVF和ASC、MFAT在滑膜迁移实验中，由于VEGF的存在，SVF有明显的迁移模式，再将SVF注射到环节的膝关节，观察到软骨细胞外基质中蛋白多糖含量的增加[23]。因此，关节内注射SVF的积极作用，最有可能通过营养和免疫调节机制，诱导宿主软骨细胞增殖并产生细胞外基质，从而影响软骨的结构和生化变化。细胞外囊泡理论也可以解释间充质干细胞对软骨再生的有限作用。尽管软骨的再生在各种出版物中都有记载，随着更多的干细胞产生更好的结果，没有一个显示出软骨完全生长到正常的、未退化的状态。这同样可以归因于这样一个事实：在受损的软骨组织中，只有有限数量的软骨母细胞和软骨细胞能够再生并产生用于软骨再生的细胞外基质。然而，在培养扩张过程中，干细胞会随着传代次数的增加而失去归巢效应。相反，脂肪SVF干细胞具有较强的归巢作用。经皮关节内注射脂肪SVF可使软骨组织再生，这可能是由于干细胞的归巢效应导致其粘附在软骨损伤部位[24]。SVF的软骨再生机制还未完整阐明，涉及直接移植和营养因子。在营养因子中，脂肪间充质干细胞来源的外泌体（exosomes）是ADSCs释放到细胞外基质的膜性囊泡，exosomes介导的旁分泌机制在ADSCs为基础的治疗中发挥重要作用，并且研究证实ADSCexosomes可以促进SVF-CD34+细胞增殖，可以通过调节CXCR4mRNA的表达提高SVF-CD34+细胞归巢效率。迄今为止，自体脂肪SVF注射是骨科领域治疗肌肉骨骼疾病的一种有前景微创的非手术性的替代方法，但由于标准化不够，仍然缺少一致的评论。

5 小结与展望

由于OA严重影响人们的生活，其并发症多、传统治疗的死亡率高、治疗的成本高，因此，OA的治疗一直是困扰国内外专家学者的一大难题。虽然自体脂肪来源的SVF在人体中的成功应用代表了一种有前景的、微创的、非手术的替代方案，近年来关于SVF治疗骨关节炎的研究也取得了很大的进展和突破，但仍有诸多不足之处。就临床前研究而言，SVF的临床前研究主要是通过手术诱发OA来制造模型，少数使用原发性OA模型和胶原酶关节内注射诱导OA模型,结果均显示SVF具有软骨修复作用和愈合能力。针对OA模型的治疗药物大多是SVF与PRP、HA等联合使用，文献检索显示，目前尚无单独应用SVF来进行治疗，因此对SVF的细胞潜在能力认识尚不清楚。在临床应用研究方面，自体脂肪来源的SVF注射是骨科领域治疗肌肉骨骼疾病的一种有前景微创的非手术性的替代方法，相关临床研究证据均表明SVF关节内注射治疗能减缓OA症状，缓解疼痛。SVF治疗OA的安全性和有效性已被证明，且能够改善其他合并症如强直性脊柱炎的发生。但由于标准化不够，有关SVF治疗效果的证据还不够充分，仍然缺少一致的评论。在作用机制方面，SVF对膝骨关节炎的治疗是通过产生多种生物活性因子，重新组装预先存在的血管以及其较强的归巢效应实现细胞增殖、新血管形成以及归巢到损伤部位。此外，SVF还可诱导软骨细胞产生细胞外基质并分泌蛋白多糖，产生巨噬细胞发挥抗炎作用。目前，外泌体被认为是软骨再生机制之一，其可促进SVF细胞的增殖并提高其归巢效率,但外泌体的作用仍缺乏科学的实验和研究。SVF在OA治疗方面的潜力巨大，为了使其更好地发挥作用，弄清它的机理显得尤为重要。

因此，为了更好地治疗OA，有必要对SVF治疗OA进行进一步的临床前研究、临床应用研究和相关作用机制研究，以期获得标准化临床治疗手段和对SVF有更为深入地认识，充分发掘其潜力。相信随着相关临床试验研究的不断深入，骨性关节炎的生物治疗将会有一个飞跃式发展！