海藻多糖对子宫内膜症大鼠炎症反应和氧化应激的影响

史 琳 焦绪栋 王程军

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 金锣医院 山东 临沂 276036；3 中国科学院烟台海岸带研究所 山东 烟台 264000

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)为常见慢性妇科疾病之一，也是不孕不育的主要原因之一，多造成卵巢囊肿[1]。EMS的主要临床症状为慢性非月经疼痛、急性骨盆疼痛、呼吸困难、阴道出血等[2]。EMS的发病机制尚不完全明确，目前认为是由环境因素或营养不良造成的一种自身免疫性疾病或激素性疾病[3]。子宫内膜受到多种内分泌激素调节，主要包括雌激素和黄体酮，激素分泌失衡参与子宫内膜症的发生和发展[4]。促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)共同调节卵泡激素的分泌。EMS患者性腺轴功能异常，对激素的敏感性明显减低。EMS患者的氧化和抗氧化系统的失衡在其发病过程中起到决定性作用，另外，局部盆腔炎症反应失衡，造成炎症因子大量积累也是发病机制之一[5-6]。EMS患者外周血中氧化应激标志物明显增加，如热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和脂质过氧化氢物等[7]，其中MDA增加显著，在EMS的诊断中具有重要意义[8]。EMS患者腹腔内多种炎症因子分泌增加，如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等，从而增加血管的通透性和组织粘连[9-10]。因此，重塑炎症反应和氧化反应平衡是改善EMS症状的关键。临床上多以药物和手术治疗EMS为主，但是存在对机体损伤大、怀孕率低、复发率高等缺陷，因此寻找简便、快捷、不易复发的新型治疗手段迫在眉睫。

海藻多糖是天然的活性物质，具有广泛的生物学活性和药用价值。近年来，海藻多糖的药理学被广泛研究，如抗病毒[11]、抗肿瘤[12]、抗氧化[13]和降血脂[14]等。海藻多糖可以显著抑制溃疡性结肠炎小鼠IL-6炎症因子的分泌[15]。海藻具有软坚散结的功效，是中医治疗EMS的常见用药。海藻多糖作为海藻的主要活性成分其对EMS保护作用尚未见报道。本研究通过制作大鼠EMS疾病模型，应用现代分子生物学技术评估海藻多糖对EMS的治疗程度，为开发新型的治疗EMS的药物提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠，体质量为200～220 g，清洁级，由北京华阜康有限公司动物研究中心提供。

1.2 主要试剂 海藻多糖(Sigma公司)，青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，Rat-FSH Elisa试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)，Rat-LH和Rat-IL-6 Elisa试剂盒(美国R&D公司)，MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要仪器 电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，微量移液器和酶标仪(Thermo公司)，石蜡切片机(Leica公司)，和普通光学显微镜(日本OLYMPUS CX3公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及模型的建立 30只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组和海藻多糖高、中、低剂量组共5组，每组各6只。参照Jones[16]的造模方法，购买大鼠后喂养1周开始造模，称量大鼠体质量，腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，给药剂量为0.3 mL/kg，等大鼠完全麻醉后，用橡皮筋把大鼠固定到鼠板上，并用棉签蘸取碘伏对腹部进行消毒处理，用镊子提起腹壁，用剪刀沿腹中线轻轻剪开腹壁，用棉签把肠道取出，放到无菌纱布上，寻找到左侧子宫角后，用结扎线结扎，并用剪刀取部分子宫组织。然后迅速把组织放入装有无菌PBS的培养皿中，用镊子去除脂肪后，把内膜剪成方形的小方块，大小约为0.5 cm×0.5 cm，用缝合针把剪好的方形内膜与腹壁一起缝合好，再把腹壁缝合好。手术后4周，再次麻醉大鼠，开腹观察。子宫内膜体积变大到约30 mm3以上，且有血管形成和水肿等病变，可以认定造模成功。造模成功后，开始灌胃给药，低剂量组为150 mg/kg，中剂量组为300 mg/kg，高剂量组为600 mg/kg，空白组和模型组给予等体积的溶剂, 每天给药1次，连续给药两周后取材。

1.4.2 组织形态学观察 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，取各组大鼠异位内膜组织，用4%的多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片和HE染色后, 光学显微镜观察各组异位内膜组织病理学变化。

1.4.3 血清FSH、LH、MDA和IL-6水平的检测 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，腹主动脉采血，3 000 rpm离心10 min，取上清，按照ELISA试剂盒的操作说明检测各组FSH、LH和IL-6的变化，同时检测各组MDA积累。

2 结果

2.1 HE染色观察内膜病理变化 HE染色后用显微镜拍照并观察各组病理变化，见图1。对照组内膜上皮呈高柱状或柱状整齐排列，界限清晰，细胞核大小适中，形态规则，可见核下空泡，间质细胞排列均匀。模型组腺体形态发生明显改变，内膜上皮呈现矮柱状，细胞核变大，细胞包浆内容物增多，细胞间质增多，细胞间隙变小，内膜增厚。海藻多糖各治疗组异位内膜均受到不同程度的抑制。低剂量组内膜组织萎缩变薄，细胞呈矮柱状，排列松散；中剂量组腺体数目减少，腺腔萎缩，功能层变薄；高剂量组部分大鼠异位内膜完全消失，呈剂量依赖性。

图1 各组大鼠异位子宫内膜的病理变化(HE染色，×400)

2.2 海藻多糖对外周血中LH水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠外周血中LH激素的水平升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中LH水平，呈剂量依赖性，中剂量组、低剂量组和高剂量组LH水平与模型组相比均降低(P<0.05)，见图2。

与对照组比较，**P <0.01；与模型组比较，#P<0.05。图2 海藻多糖对外周血中LH水平的影响

2.3 海藻多糖对外周血FSH水平变化的影响 FSH水平也是反映EMS造模是否成功的常用指标。同LH一样，模型组大鼠外周血中FSH激素的水平与对照组相比也升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中FSH水平，呈剂量依赖性，中剂量组、低剂量组和高剂量组FSH水平与模型组相比均降低(P<0.05)，见图3。

与对照组比较，**P <0.01；与模型组比较，#P<0.05。图3 海藻多糖对外周血FSH水平的影响

2.4 海藻多糖对外周血中IL-6分泌的影响 模型组大鼠外周血中IL-6的水平与对照组比较升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中IL-6的水平，呈剂量依赖性，中剂量组、低剂量组和高剂量组IL-6与模型组相比均降低(P<0.05)，见图4。

与对照组比较，**P <0.01；与模型组比较，#P<0.05。图4 海藻多糖对外周血中IL-6分泌的影响

2.5 海藻多糖对外周血中MDA水平的影响 MDA是脂质分子过氧化的产物，检测各组血清中MDA的水平变化可以反映海藻多糖对氧化应激的影响。模型组大鼠外周血中MDA的水平与对照组比较升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中MDA水平，呈剂量依赖性, 中剂量组、低剂量组和高剂量组MDA水平与模型组相比均降低(P<0.05)，见图5。

与对照组比较，**P <0.01；与模型组比较，#P<0.05。图5 海藻多糖对外周血中MDA水平的影响

3 讨论

EMS是育龄妇女的常见病，发病率高达10%～15%，由于EMS的发病机制不明确，治疗方法需不断完善。目前EMS的治疗方法主要包括手术治疗和药物治疗，但是效果不理想，无论是药物还是保守性手术均有相当高的复发率。海藻多糖具有多种抗炎和抗氧化作用，可以抑制炎症反应和氧化损伤来减轻关节炎过度损伤[18]。

本研究发现不同剂量海藻多糖对EMS均具有不同程度的改善作用，其机制主要通过抑制症因子的分泌和过氧化物的积累发挥作用。EMS是激素依赖性疾病，体内雌激素水平平衡失控促进了EMS的发生和发展[17]，体内FSH和LH的水平升高，并作用于卵巢促进雌激素的分泌[18]。本研究表明，海藻多糖对EMS大鼠高水平的FSH和LH均有抑制作用，高剂量组使其趋于正常水平，调节激素内分泌系统的紊乱可能是其治疗EMS的作用机理之一。

在EMS患者腹腔液中，腹腔巨噬细胞活化分泌大量炎症因子，从而抑制巨噬细胞的吞噬[19]。本研究表明，海藻多糖抑制EMS大鼠血中IL-6的分泌，使其趋于正常水平，其抗炎作用可能是其治疗EMS的作用机理之一。本研究检测了外周血中MDA水平，发现海藻多糖可以抑制EMS大鼠血清中MDA的积累，使其趋于正常水平，其抗氧化作用可能也是其治疗EMS的另一作用机制。

综上所述，海藻多糖可以抑制卵巢部位异位内膜的生长，降低外周血中激素水平，调节机体免疫失调和氧化还原失衡。提示海藻多糖确实对EMS大鼠的病情发展有确切的疗效，值得进行下一步临床研究。