天麻对乳酸菌发酵过程中蛋白质含量变化的影响研究

黄先敏，韩立乾，陈 宇，范 莉，张可满

昭通学院农学与生命科学学院，云南昭通 657000

0 引言

乳酸菌在人类生活中应用广泛，已有几千年的历史[1]，是一种有利于人体健康的益生菌，以活的菌体进入到人体内[2]，具有帮助消化、保持肠道健康[3]、帮助钙质吸收、防止腹泻、癌症[4]、消除便秘及制造维生素等作用。同时还有改善人体肠道菌群，调节机体免疫力[5]，抑肿瘤，降低血清胆固醇，调节血压等重要的生理活性[6]。其中的保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.thermophiles）是人体肠道中的重要微生物，具有较高的经济价值和研究价值[7]。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在酸乳发酵过程中具有不同的发酵特性，在不同的发酵时期表现出不同的代谢性能[8]。嗜热链球菌在发酵牛乳时，具有产酸快、生长快的特点，从而营造出一种适合另一种乳酸菌（保加利亚乳杆菌）生长的酸性环境[9]。这两种菌种互利共生，对人体起着有益作用[10]。牛乳中含有丰富的营养物质，两种菌混合发酵时，先将酪蛋白降解为肽类和氨基酸，以满足菌种对含氮类物质的需要[11]，同时将大分子物质蛋白质降解为小分子物质（氨基酸、肽）有利于人类的吸收利用。

天麻是我国传统名贵中药，已有几千年的药用历史[12]。天麻中含有蛋白质、氨基酸、巴利森苷、天麻素、天麻苷元、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸以及天麻多糖等多种活性物质[13]，其中天麻素和天麻苷元是其主要的活性物质[14]。药理研究表明，天麻素具有镇静催眠、抗癫痫、镇痛、保护神经元细胞和抗氧化、抗炎、增强机体免疫力等多种作用[15，16]。巴利森苷类物质是近年来在天麻中发现含量较高的活性物质，是一种以结合态存在的天麻素，即天麻素和柠檬酸缩合而成的酯类成分。巴利森苷类活性物质可代谢成天麻素类衍生物，具有改善学习记忆的作用，且效果比天麻素单体更强，有望成为新一代抗痴呆药的先导物[17～19]。天麻苷元具有镇静、催眠、抗惊厥、抗抑郁、改善记忆力、抗炎、抗肿瘤、抑制血小板凝集以及脑缺血保护作用[20，21]。天麻运用在人体及其他动物方面的研究报道较多，而运用在微生物方面的研究未曾见有过报道。本论文将天麻中的有效成分提取出来，加入到乳酸菌的培养基中，通过测定蛋白质的含量变化，以此得出天麻提取液对乳酸菌发酵过程中蛋白质含量变化的影响情况。

1 材料和方法

1.1 试验材料

天麻（昭通市神农乌天麻良种繁育有限公司提供）；纯牛奶（昆明雪兰牛奶有限责任公司）；乳酸菌菌种为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合菌种（来源于来思尔裸酸奶，云南皇氏来思尔乳业有限公司生产）；蔗糖（云南楚雄禄丰县平浪镇舍资街）。

1.2 试验方法

以添加纯净水的乳酸菌培养基为对照（CK组），对添加天麻提取液的乳酸菌培养基中的蛋白质含量进行测定。试验设置6 个重复，样品中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。蛋白质含量采用下列公式进行计算，数据采用SPSS软件进行分析。

1.2.1 天麻提取液的制备

准确称取天麻粉（80 目）20.000 g于干净烧杯中，加入200 mL的娃哈哈纯净水。用FA25高剪切分散乳化机在转速为10 000 r/min、时间为10 min的条件下，将其搅拌均匀。将混合液分装入离心管内，然后用A K 高速冷冻离心机离心，转速为8 800 r/min，时间6 min，上清液为天麻提取液，倒出备用。

1.2.2 乳酸菌发酵培养基的制备

CK组的乳酸菌培养基配方及比例：鲜牛奶62.57%、白砂糖8.39%、纯净水为16.52%；添加天麻提取液的乳酸菌培养基配方则是将纯净水换为天麻提取液，占整个培养基的比例为17%。配制好培养基后，按培养基总量的12.51%添加裸酸奶作为菌种。将接种好乳酸菌菌种的培养基，放在40 ℃的BIC-250人工气候培养箱内进行发酵培养。

1.2.3 乳酸菌发酵过程的观察及材料的收集

将刚接种好未进行培养的时间设为0 min，然后每隔20 min，观察一次，并记录培养基的组织质构状态，直到740 min为止。再根据发酵液在不同时间段组织形态及质构的变化，收集不同时间段（0 min、80 min、140 min、160 min、200 min、240 min、360 min、420 min、500 min、600 min、740 min）的发酵液进行蛋白质含量的测定分析。共收集22 份样品（CK组和加入天麻提取液两组培养基，每组各11 份样），放入冷藏箱中备用。

1.2.4 样品溶液的制备

将收集的发酵液在冰浴的条件下，搅拌20 min后，取5 mL发酵液，加入10 mL娃哈哈纯净水稀释，摇晃均匀，再冰浴6 min后，倒入离心管，用HR立式高速冷冻离心机在转速为4 000 r/min，温度为4 ℃条件下，离心6 min。取上清液定容至50 mL的容量瓶中，待用。

1.2.5 样品溶液的测定

取样品溶液1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝染液，充分摇晃均匀后，静置5 min，用722N分光光度计在595 nm波长下，测其吸光度。

1.2.6 标准溶液的配制及标准曲线的制作

标准溶液的配制：称取50 mg结晶牛血清白蛋白标品，溶解定容于50 mL容量瓶里，作为母液。分别取母液5 mL和10 mL定容至两支50 mL的容量瓶中，配成100 μg/mL、200 μg/mL的标准溶液。再分别取0 mL、2 mL、4 mL、8 mL的100 μg/mL的标准溶液和6 mL、8 mL、10 mL的200 μg/mL的标准溶液于一组小烧杯中，加纯净水稀释至10 mL，配制一系列浓度梯度为0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL及200 μg/mL的溶液。

标准曲线的制作：取上述溶液1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝染液，充分摇晃均匀后，静置5 min，在595 nm波长下测其吸光度。以所测得的吸光度为横坐标，质量浓度为纵坐标，可得蛋白质的标准曲线图，如图1。

从图1中可见，吸光度与质量浓度间的线性关系式为y=199.74x-1.3676（R2=0.9965）。表明在0～200 μg/mL的溶液浓度范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。

1.2.7 仪器的精密度、准确性及重复性试验

图1 蛋白质标准曲线图

取发酵80 min的CK培养基样品，参照1.2.4的步骤进行冰浴、离心处理，再按照1.2.5的步骤重复6 次测定，得其吸光度。经过计算，得其RSD值为1.844%，可知仪器的精密度好、准确性高、重复性强。

2 结果与分析

2.1 两种乳酸菌培养液的显微结构

用10 倍稀释梯度法制作发酵液的菌悬液，采用血细胞计数板进行制片，在CX40光学显微镜下观察，对发酵液中的乳酸菌细胞进行拍摄，见图2和图3。

图2和图3所拍摄的是在同一发酵时间段内，发酵液中乳酸菌的显微形态图。从图2和图3中可以看出，添加纯净水的发酵液中，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的细胞相对于添加天麻提取液的细胞小且数量少，两种发酵液中的嗜热链球菌都为球形，呈分散分布状态，保加利亚乳杆菌呈短杆状分散分布。

图2 添加天麻提取液的显微图（放大倍数10×40）

图3 添加纯净水的显微图（放大倍数10×40）

2.2 两种乳酸菌培养液的质构变化

设置每20 min间隔观察一次，观察两组发酵液的形态和质构变化，将发酵液形态和质构变化明显时间段的情况进行汇总，结果见表1。

从表1中可以看出，添加天麻的发酵液凝乳速度较CK组快，80 min时观察到添加天麻的发酵液液体流动感减弱，已经开始凝乳，而CK组的发酵液还呈液体状态；添加天麻的发酵液在200 min时黏稠感加强，到240 min时完全凝固，而CK组的发酵液在200 min时流动感才开始减弱，240 min才开始有黏稠感；CK组发酵液凝固相对于天麻提取液延后140 min。添加天麻提取液的发酵液从340～740 min间，依次出现凝固不均匀，四周有淡黄色液体，上层有液体析出，分层明显的现象产生；而CK组的发酵液是从500～740 min间，依次出现凝固不均匀，四周有液体及上层有液体析出的现象，表明天麻提取液有促进乳酸菌生长代谢的作用。

2.3 不同发酵时间段的蛋白质的含量

将所测样品溶液的吸光度，代入吸光度与质量浓度的线性关系式中，应用1.2的公式可得样品溶液中的蛋白质含量（μg/mL），结果见表2。

表2 不同发酵时间段中蛋白质的含量（µg/mL）

由表2可知，添加天麻提取液的起始蛋白质含量为18 371.78 μg/mL，高于添加纯净水的起始蛋白质含量15 803.75 μg/mL，这是因为箭麻中含有蛋白质的量为6.96%[22]。添加天麻提取液的蛋白质含量在360 min时，下降到最低点，为446.24 μg/mL，CK组的蛋白质含量在420 min时，下降到最低点，为451.73 μg/mL，可见天麻提取液具有促进蛋白质降解的作用；添加天麻提取液和CK组在360～740 min和420～740 min两个发酵时间段中的蛋白质含量变化不大。

以时间为横坐标，不同发酵时间段的蛋白质含量为纵坐标，作成不同发酵时间段的蛋白质含量变化曲线图，见图4。

从图4 中可以看出，在0 ～1 4 0 m i n 的发酵过程中，二者蛋白质含量下降的趋势都非常平缓。这是因为二者都处于发酵前期，对于嗜热链球菌来说，菌株接种后可利用牛奶中丰富的氨基酸、二肽、三肽及寡肽迅速进入对数生长期[10]。在140～160 min的发酵过程中，CK组的蛋白质含量大幅度下降。这是因为嗜热链球菌对氨基酸的利用受限，使得与其共同作用的保加利亚乳杆菌开始水解蛋白质为肽类来供它生长利用[23]；而添加了天麻提取液的蛋白质含量变化幅度不大，这是因为天麻本身含有丰富的氨基酸[22]，所以发酵液中有氨基酸供给嗜热链球菌生长利用。在1 6 0 ～2 0 0 m i n 的发酵过程中，添加天麻提取液和C K 组的蛋白质含量都大幅度下降，这是因为随着乳酸菌的生长代谢，嗜热链球菌开始进入稳定期，而伴随着p H 值的下降，保加利亚乳杆菌的生长代谢开始变得旺盛[11]。在2 4 0 ～7 4 0 m i n 的发酵过程中，二者的蛋白质含量都趋于平稳。这是因为进入了发酵后期，保加利亚乳杆菌的生长进入了稳定期[11]。

图4 不同发酵时间段的蛋白质含量变化图

2.4 发酵液中的蛋白质被乳酸菌转化的利用率

2.4.1 蛋白质的转化利用率

根据发酵液中的蛋白质含量出现的最高点和最低点，可以算出发酵液中乳酸菌对蛋白质的转化利用率，如表3。

由表3中的数据可看出：添加天麻提取液蛋白质的转化利用率为97.41%～97.71%，平均转化利用率为97.56%，CK组蛋白质的转化利用率为96.91%～97.25%，平均转化利用率为97.14%。

2.4.2 转化利用率的方差分析

为了进一步分析添加天麻提取液蛋白质转化率和对照组之间是否存在差异显著性，采用SPSS软件进行方差分析。蛋白质的转化利用率在96.91%～97.71%之间，要对数据进行反正弦转换，转换后的数据见表4。

对表4中的数据进行方差分析，分析结果见表5。由表5可知，经方差分析得F=31.38，查F临界值表[24]，当α=0.05，α=0.01，df1=1，df2=10时，F0.05（1，10）=4.96，F0.01（1，10）=10.04，可知F＞ F0.01（1，10），说明在1%显著水平上，添加天麻提取液和对照组之间的蛋白质转化利用率存在极显著差异性。

表3 蛋白质的转化利用率

表4 蛋白质转化利用率的反正弦值

表5 反正弦值的方差分析

3 讨论

通过试验中可以看出，添加天麻提取液的乳酸菌细胞较CK组的细胞大，同时数量多，添加天麻提取液的乳酸菌细胞的生长代谢快于CK组细胞的生长代谢。在两种培养基中蛋白质的转化率具有差异显著性，添加天麻提取液的蛋白质降解量为17 925.54 μg/mL，CK组为15 352.02 μg/mL ，二者的降解量相差2 573.52 μg/mL。添加天麻提取液乳酸菌培养基中起始蛋白质的含量为18 371.78 μg/mL，CK组起始蛋白质的含量为15 803.75 μg/mL，添加天麻提取液乳酸菌培养基中起始蛋白质的含量高于CK 2 568.03 μg/mL。发酵结束后，两组发酵液中的蛋白质含量相差不大，而发酵前添加天麻提取液中的蛋白质含量远远高于CK组，说明天麻提取液有促进乳酸菌降解转化蛋白质的作用。

本试验所用菌种是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，利用两种乳酸菌混合发酵，能促进菌株的生长繁殖。乳酸菌发酵牛乳的一个重要作用是产黏，黏度的产生是由于嗜热链球菌不断产酸，p H 值下降，造成酪蛋白的凝固，乳酸菌分泌的多糖，使发酵液呈现出均一、黏稠的状态[25]。在共生过程中，保加利亚乳杆菌利用蛋白酶水解乳蛋白，产生小分子的肽和游离的氨基酸，为嗜热链球菌提供相应的氮[26]；同时嗜热链球菌能为保加利亚乳杆菌提供生长代谢所需的酸和C O2作为辅助因子，从而促进其快速生长[27]。混合发酵还能提高氨基酸和短肽的产量，使更多的风味物质得以生成，改善酸乳的品质[28]。

本试验在乳酸菌的培养基中加入天麻提取液，测定不同发酵时间段内发酵液中蛋白质的含量，可知天麻对乳酸菌发酵过程中蛋白质的降解有促进作用。天麻作用于人体的药用功效研究较多，但在微生物方面的研究运用未曾有过报道。本试验结果为进一步开发利用天麻的其他用途提供理论依据，同时为丰富乳酸菌可利用代谢产物找到一条新的路径。