长期饲喂柑橘提取物对肥育猪血液生化指标、抗氧化能力、免疫功能以及游离氨基酸的影响

崔艺燕 田志梅 鲁慧杰 邓 盾 容 庭 李贞明 王 刚 马现永,2*

(1.广东省农业科学院 动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室/广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州 510640；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000)

中华人民共和国农业农村部第194号公告提出，2020年7月1日起饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。然而，在禁抗大环境下，集约化、规模化养殖导致的氧化应激和炎症反应仍然是生产过程中无法忽视的严重问题，促生长抗生素的禁用直接或间接地限制了养殖业的发展。因此，寻找、开发经济适用的环保健康型饲用抗生素替代产品，对提高机体抗氧化能力和免疫功能，改善动物的生产性能和产品质量具有重要意义。

近年来，植物源饲料添加剂引起了人们的广泛关注，植物提取物作为抗生素替代产品在动物生产中的使用也有了显著增加[1]。柑橘是常见的芳香植物，富含黄酮(橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川陈皮素等[2])、酚类、生物碱、萜类和维生素等功能活性物质[3]，是人类饮食中总黄酮或特定黄烷酮的主要来源[4]。柑橘提取物成分明确，具抗氧化[5]、抗炎[6]、抗菌[5]、抗癌[7]和抗肥胖[2]等多样的生理活性，在制药、食品和保健品等领域具有广泛的应用，是潜在的饲用抗生素替代品之一。目前，我国柑橘资源具有种植范围广、产量大等特点[8]，其副产品是高值化合物的具有经济效益和可再生的资源。已有研究表明，柑橘提取物对猪痢疾短螺旋体菌株具有很好的杀菌效力[9]。柑橘黄酮类物质会干扰致癌物质的活化，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖及癌基因活性[10]。此外，有研究表明，纯化的柑橘活性化合物可提高绵羊机体的抗氧化能力[11]，也可促进仔猪[12]和羔羊[13]的生长。柑橘提取物也可提升肉鸡[14]和仔猪[15-16]的免疫能力。

动物血液参数反映了机体的代谢状况[17]。补充适量的活性成分或添加剂可以调节机体的代谢功能，改变整体健康状态，减少集约化生产带来的应激危害[18]。橙皮苷可以减缓肝细胞氧化应激，抑制肝损伤的发生[19]。目前，尚不清楚长期饲喂柑橘提取物是否会对猪机体抗氧化、免疫和肝损害等方面造成负面影响。因此，本研究通过分析柑橘提取物对肥育猪血液生化指标、抗氧化能力、免疫功能和游离氨基酸的影响，旨在评估长期补充柑橘提取物对肥育猪机体代谢的状况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金霉素购自广东某饲料科技有限公司，柑橘提取物由广东某环保科技发展有限公司提供。柑橘提取物含有3.04%维生素C、2.38%维生素E、2.89%柠檬酸和20.77%总黄酮。

选取108头56日龄19.73±0.39 kg杜×长×大猪，公母各半。按体重随机分配到3组，每组6个栏，每栏6头猪。体重达120 kg时结束试验。

1.2 试验设计

空白组为基础饲粮；抗生素组在基础饲粮上添加75 g/t金霉素；柑橘提取物组在基础饲粮上添加柑橘提取物(56～112 d 添加250 mL/t柑橘提取物，113～194 d添加200 mL/t柑橘提取物)。

1.3 试验饲粮

基础饲粮组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

1.4 饲养管理与采样

试验在广东省农业科学院动物科学研究所猪场进行。根据养殖场常规程序进行饲养管理。试验结束，选取每栏接近平均体重的2头肥育猪进行耳静脉采血，分别采用肝素钠抗凝管和普通管收集血液，共36头猪。肝素钠抗凝管血液颠倒混匀后室温静置30 min，经3 500 r/min、4 ℃离心10 min，收集血浆，-80 ℃保存。普通管血液室温静置4 h，待血液凝固后经3 500 r/min、4 ℃离心10 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.5 生化指标测定

采用血浆测定生化指标。总胆固醇(F002-1-1)、甘油三酯(F001-1-1)、葡萄糖(F006-1-1)、尿素氮(C013-2-1)、白蛋白(A028-1-1)、总蛋白(A045-2-1)、谷草转氨酶(GOT，C010-1-1)、谷丙转氨酶(GPT，C009-1-1)和碱性磷酸酶(AKP，A059-1-1)等测试盒购于南京建城生物工程研究所，具体步骤按说明书进行。

1.6 抗氧化指标测定

采用血浆测定抗氧化指标。总蛋白(A045-2-1)、丙二醛(MDA，A003-2-2)、总抗氧化能力(T-AOC，A015-1-2)、总超氧化物岐化酶(T-SOD，A001-1-2)、过氧化氢酶(CAT，A007-1-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，A005-1-2)等测定试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所，具体操作按说明书进行。

1.7 免疫指标测定

采用血清测定免疫指标。猪白介素IL-2、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和猪免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等测试盒均购自北京方程生物科技有限公司，具体操作按说明书进行。

1.8 游离氨基酸含量测定

根据文献[15]的方法，游离氨基酸的含量通过自动氨基酸仪(L-8900，HITACHI，日本)测定。准确吸取400 μL血浆，加入1.2 mL 10%的磺基水杨酸并充分混合。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，用0.22 μm滤膜过滤上清液进行测定。

1.9 数据处理

用 SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并用 Duncan 氏法进行多重比较。结果用平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为有趋势。

2 结 果

2.1 柑橘提取物对肥育猪血浆生化指标的影响

由表2可知，柑橘提取物组和抗生素组血浆尿素氮含量差异不显著(P>0.05)，但与空白组相比，这两组尿素氮含量分别显著降低了19.66%和15.53%(P<0.05)。与抗生素组相比，柑橘提取物有降低血浆总胆固醇含量的趋势(0.05≤P<0.10)，与空白组无显著差异(P>0.05)。3组间其他生化指标无显著差异(P>0.05)。表明柑橘提取物改善了肥育猪血浆生化指标，与抗生素效果相似。

表2 柑橘提取物对肥育猪血浆生化指标的影响Table 2 Effects of citrus extract on the plasma biochemical indexes of finishing pigs

2.2 柑橘提取物对肥育猪血浆抗氧化能力的影响

由表3可知，柑橘提取物组和抗生素组血浆T-AOC 含量差异不显著(P>0.05)。与空白组相比，柑橘提取物组T-AOC含量显著提高了67.21%(P<0.05)，而抗生素组与空白组差异不显著(P>0.05)。3组间其他抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。表明柑橘提取物和抗生素提高了肥育猪抗氧化能力，二者功效相似。

表3 柑橘提取物对肥育猪血浆抗氧化能力的影响Table 3 Effects of citrus extract on the plasma antioxidant capacity of finishing pigs

2.3 柑橘提取物对肥育猪血清免疫指标的影响

由表4可知，柑橘提取物和抗生素组血清IgA和IgM浓度差异不显著(P>0.05)。但与空白组相比，抗生素和柑橘提取物组IgA浓度分别显著提高了13.17%和15.50%(P<0.05)。抗生素组较空白组显著降低了IgM浓度(P<0.05)，柑橘提取物组与空白组的IgM浓度差异不显著(P>0.05)。3组间IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和IgG浓度均无显著差异(P>0.05)。表明柑橘提取物改善了肥育猪的免疫功能，效果优于抗生素。

表4 柑橘提取物对肥育猪血清免疫指标的影响Table 4 Effects of citrus extract on the serum immune indexes of finishing pigs

2.4 柑橘提取物对肥育猪血浆游离氨基酸的影响

由表5可知，柑橘提取物组血浆亮氨酸浓度较抗生素组显著提高了11.74%(P<0.05)，较空白组提高了11.10%(P<0.05)，抗生素组与空白组差异不显著(P>0.05)。与空白组和抗生素组相比，柑橘提取物组脯氨酸浓度有提高的趋势(0.05≤P<0.10)。柑橘提取物和抗生素组天冬酰胺、谷氨酸和丙氨酸的含量差异不显著(P>0.05)，但与空白组相比，二者显著提高了天冬酰胺、谷氨酸和丙氨酸的含量(P<0.05)。3组间其他氨基酸含量差异不显著(P>0.05)。表明柑橘提取物提高了血浆游离氨基酸含量，效果优于抗生素。

表5 柑橘提取物对肥育猪血浆游离氨基酸的影响

3 讨 论

3.1 柑橘提取物对肥育猪血浆生化指标的影响

血液是机体内环境的重要组成，是机体与外界环境以及体内各组织之间物质交换的媒介[20]。本试验重点分析柑橘提取物对肥育猪生理代谢的影响，各组间生长性能没有显著差异(未发表数据)。机体的代谢状况可以通过生物化学相关参数来反映。血液总蛋白、白蛋白和尿素氮可以反映动物蛋白质的整体代谢[17]。在正常范围内，总蛋白和白蛋白含量越高，机体合成蛋白质的能力越强。本研究表明，长期饲喂柑橘提取物和抗生素对肥育猪血浆总蛋白含量无影响。Akbarian等[21]研究报道，在热条件下，200和400 mg/kg橙皮提取物可显著提高肉鸡血清总蛋白水平。与本研究结果不一致，这可能是肉鸡和肥育猪的动物差异，以及不同提取物中有效成分种类、纯度或组成不同导致的。尿素氮可以用作蛋白质利用效率的指标[22]。尿素氮浓度与氮沉积速率和蛋白质利用率呈负相关[23]，若尿素氮减少，则表明氮利用效率增加或蛋白质分解减少。本研究表明，长期饲喂柑橘提取物和抗生素显著降低了血浆尿素氮的含量。这意味着柑橘提取物和抗生素增强了机体氮代谢、提高了氨基酸利用效率，改善了机体对蛋白质的利用。柑橘提取物与抗生素具有相似的效果。

关于柑橘提取物对动物血脂代谢的报道很少。补充柠檬提取物可降低肥育猪胆固醇水平，但不会改变血液中甘油三酯的水平[24]。研究报道，与基础日粮组相比，饲粮中添加柑橘提取物可降低肉鸡和母羊血清总胆固醇含量[21,25]。而本研究表明，柑橘提取物未能降低肥育猪血浆总胆固醇的含量，而抗生素有提高胆固醇含量的趋势。柑橘成分β-隐黄质可显著抑制肥胖小鼠血脂水平的升高，而对正常小鼠无明显影响[26]。柑橘提取物对血脂的影响不一致，这与提取物成分和动物种属密切相关。有研究表明饲喂抗生素14 d对小鼠血清总胆固醇和甘油三酯无影响[27]。本试验长期饲喂抗生素对胆固醇的提高，可能由于抗生素的长期饲喂影响了机体的脂代谢。

GOT和GPT是反映肝功能的重要指标，当肝细胞受损或细胞膜通透性增加时，二者会渗透到血液中，增加血液转氨酶活性[28]。有研究报道，口服柚皮苷的绵羊血清GOT活性显著下降，表明柚皮苷对肝脏健康有改善作用[13]。在本研究中，长期饲喂柑橘提取物和抗生素的肥育猪血浆GOT和GPT水平与空白组均无显著差异，这表明长期饲喂柑橘提取物和抗生素未对肥育猪肝脏造成损害。转氨酶与氨基酸的代谢强度相关，在非必需氨基酸合成和蛋白质分解过程起重要作用[29]。肝功能正常时，转氨酶活性的提高表示蛋白质合成和分解代谢速度加快。柑橘提取物在数值上提高了转氨酶的活性，这也反映了机体蛋白质和氨基酸合成代谢强度较快。这与尿素氮水平下降反映的蛋白质利用率提高一致。

3.2 柑橘提取物对肥育猪血浆抗氧化的影响

氧化应激会损害细胞抗氧化系统和减少畜牧业生产。抗氧化酶和T-AOC是反映机体抗氧化能力的重要指标[30]。MDA反映机体脂质过氧化受损情况[31]。前述二者紧密相关，抗氧化酶活性随脂质过氧化增加而下降[31]。植物黄酮类化合物被认为是动物生产中合成生长促进剂的天然替代品，可强化抗氧化防御机制[32]。研究报道，柠檬精油较基础日粮组提高母羊T-AOC[25]。本研究结果表明，长期饲喂柑橘提取物显著提高了肥育猪血浆T-AOC，与上述研究一致。与对照组和柠檬皮提取物组相比，橙皮提取物显著增加肉鸡血液GSH-Px活性[21]。高温条件下口服柚皮苷可增加羔羊血浆SOD和GSH-Px活性[13]。橙皮苷通过提高T-AOC、SOD活性和降低MDA浓度，改善脂多糖胁迫肉鸡血浆氧化状态[33]。从以上研究可以看出，柑橘提取物具有较好的抗氧化能力，能减缓集约化生产导致的氧化应激状态。不同的是柑橘提取物对不同动物的作用效果存在差异，如对抗氧化酶活性和MDA含量的反应不同。另外，还需考虑到提取物与纯化物的组成、浓度、添加量和使用时间的影响。

3.3 柑橘提取物对肥育猪血清免疫指标的影响

免疫球蛋白具有免疫调节功能，是体液免疫的重要指标，对机体健康十分重要。IgA对机体提供被动免疫[34]。IgG参与免疫记忆，反映机体全身免疫状态[37]。IgM产生于初级免疫应答[36]。本试验发现抗生素和柑橘提取物提高肥育猪血清IgA含量，抗生素降低了IgM含量。本课题组曾报道，柑橘提取物和抗生素能够提高仔猪血清IgA和IgG含量，促进机体健康[16]。大鼠口服橙皮苷增加血清IgM的含量，对IgG和IgA含量无影响[37]。Pourhossein等[14]发现，甜橙皮提取物通过增加血清IgG和IgM的产生来增强肉鸡的免疫力。摄入橙皮苷对致敏大鼠血清IgA无变化[38]。研究报道，抗生素饲喂小鼠14 d，克林霉素显著降低血清IgA的含量，氨苄青霉素增加IgG的含量[27]。不同抗生素对机体免疫反应的效果也是不一致的，这主要是由于抗生素的种类和作用机制决定的。可见长期饲喂柑橘提取物对肥育猪免疫功能有一定改善作用。

3.4 柑橘提取物对肥育猪血浆游离氨基酸的影响

游离氨基酸的分布反映了来自所有组织和器官的营养素及其代谢产物的总代谢流[39]。游离氨基酸是肌肉蛋白质合成所需氨基酸的主要直接来源，是机体蛋白质更新的关键指标[40]。本研究表明，长期饲喂柑橘提取物和抗生素的肥育猪血浆中丙氨酸、谷氨酸和天冬酰胺含量较高。这些氨基酸参与三羧酸循环和尿素循环。血浆中谷氨酸和天冬酰胺的浓度较高可能反映了对蛋白质的消耗[41]。机体氨基酸分解较快时会使转氨反应加快，产生较多的氨，谷氨酸浓度也会升高[42]。过多的氨和谷氨酸在酶的催化下转化为谷氨酰胺[43]，由于反应可逆，谷氨酰胺处于动态平衡，其含量无显著差异。柑橘提取物也提高了亮氨酸和脯氨酸的含量。这些氨基酸浓度的增加可能是由于氨基酸分解代谢增加所致。或者，可能归因于饲粮中氨基酸的生物利用度增加。亮氨酸主要参与蛋白质的合成与分解代谢过程，刺激蛋白质合成，抑制蛋白质降解[44]。亮氨酸含量的提高与尿素氮水平下降是一致的，这从另一角度说明，柑橘提取物改善了氮的消化率，增加了氨基酸利用度。Pi等[45]研究认为，抗生素降低生长猪血清赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的浓度，而这些氨基酸的回肠表观消化率增加或保持不变。这些影响可能是由于抗生素或柑橘提取物诱导的肠道微生物群氨基酸发酵的变化，尚需进一步研究验证。

免疫刺激可以将氨基酸从蛋白质保留重新分配到免疫应答相关过程，从而影响氨基酸的利用[46]。丙氨酸、谷氨酸和亮氨酸在免疫过程中起重要作用[47-48]。柑橘提取物组丙氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量的提高与IgA水平的提高一致，抗生素组丙氨酸和谷氨酸含量与IgA水平显著高于空白组，这表明柑橘提取物和抗生素提高了机体的免疫能力，二者具有相似的免疫效果。

部分氨基酸对组织氧化应激具有保护作用，如脯氨酸调节细胞内的氧化还原环境并保护细胞免受氧化应激[49]。亮氨酸可提高谷胱甘肽转移酶和CAT的活性，丙氨酸可增强谷胱甘肽还原酶活性[50]。这2种氨基酸含量的提高，与柑橘提取物组血浆T-AOC的提高是一致的，即柑橘提取物具有较好的抗氧化效果。