应用自研载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻保存羊卵巢组织的效果比较

崔妍婷，杨璐恺，刘 金，韩亦龙，陈 超，邓晓惠，蒋利刚

山东大学齐鲁医院不孕不育诊疗中心，济南 250012

近年来女性癌症发病年龄趋于年轻化，许多患者在确诊时仍有生育要求[1]，然而癌症治疗会造成不同程度的卵巢组织损伤，甚至卵巢衰竭。卵巢组织冷冻作为生育力保存方法之一，具有其独特优势。目前已有130余名婴儿通过此技术诞生[2]。卵巢组织冷冻方法主要有两种，相较于出现较早的慢速程序化冷冻，玻璃化冷冻因其操作简单、省时、经济等特点成为研究热点。玻璃化冷冻能够迅速通过冷冻敏感区，最大程度减少冰晶形成对细胞的机械性损伤和冻融效应[3]。快速降温是玻璃化冷冻减少组织损伤的关键，封闭式冷冻载体管壁较厚，影响降温速率，冷冻保存效果不理想[4]。本研究采用自研载体进行玻璃化冷冻，以探讨自研载体在羊卵巢冷冻中的效果。

材料和方法

实验动物及分组于山东省济南市小寨屠宰场选取8～10月、体重约30 kg的未孕母羊16只，共获取32只羊卵巢。获取的卵巢组织置于杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)中，4 ℃条件下，2 h内送达实验室。去除髓质保留卵巢皮质厚约1 mm，切成8 mm×4 mm×1 mm大小的组织块，磷酸盐缓冲液反复清洗3次，整个处理过程于冰板上进行。共获取卵巢皮质64块，通过简单随机抽样方式分为新鲜组、程序化冷冻组、自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组，每组各16块皮质，其中8块用于体外培养，另外8块用于制作石蜡切片。

主要试剂及材料二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、DPBS、蔗糖、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)等均购自Sigma公司；MEM培养液(美国HyClone公司)；重组卵泡刺激素(recombinant-follicle stimulating hormone，r-FSH)(长春金赛药业股份有限公司)；10 ml/L胰岛素铁硒传递蛋白(insulin transferrin selenium，ITS)(Gibco)；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(瑞士罗氏公司)；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)。

自研载体由冷冻管及承载部两部分构成，卵巢组织平铺于承载部，在液氮平面以下将承载部放入冷冻管，拧上冷冻管帽。既保持良好的密封性，防止卵巢组织的交叉感染，同时也方便使用者操作。自研载体I的承载部为80目不锈钢金属筛网，大小为2.0 cm×0.5 cm；自研载体Ⅱ承载部为聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料超薄载体片，大小为1.8 cm×0.6 cm，载体片上有3列小孔，直径为0.8 mm，孔间距为0.8 mm。

卵巢组织的程序化冷冻及复苏程序化冷冻与玻璃化冷冻的基础液均为DPBS+10% FBS。将卵巢组织放入装有冷冻液(基础液+10% DMSO)的冷冻管中，2 ℃预冷30 min。参照Gosden等[5]建立的程序化冷冻方法。

卵巢组织的玻璃化冷冻及复苏采用Kagawa等[6]描述的方法并加以改进。室温下依次放入平衡液(基础液+7.5% DMSO+7.5% EG)中25 min，冷冻液(基础液+20% DMSO+20% EG+0.5 mol/L蔗糖)中15 min，将组织平铺于自研载体上，置入液氮中快速晃动，液氮停止沸腾后，在液氮平面下装入冷冻管中。14 d后解冻，解冻时在空气中停留10～20 s，放入37℃水浴箱中的复苏液1(基础液+1 mol/L蔗糖)1 min，再依次放入常温复苏液2(DPBS+0.5 mol/L蔗糖)、基础液各5 min。

卵巢组织体外培养培养液主要成分为5% FBS、0.5 IU/ml r-FSH、1% ITS、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素、MEM培养液，将卵巢组织处理成2 mm×2 mm×1 mm大小，每组40块，通过简单随机抽样方式均分成8小组，放入12孔板中，每孔加培养液2 ml，于37℃、5%培养箱中培养，隔天测培养液内雌激素含量，每次测量取0.5 ml培养液并补充等量培养液。使用罗氏自动生化分析仪测定雌激素水平。

卵巢组织形态学分析将各组卵巢组织进行常规固定、包埋后4 μm厚连续切片行HE、PCNA及TUNEL染色，在光学显微镜下(×200)统计正常形态及异常形态的原始和初级卵泡数。卵母细胞完整、核仁清晰、颗粒细胞排列规则为形态正常卵泡；卵母细胞皱缩、核固缩、胞质内可见空泡、颗粒细胞排列紊乱为形态异常卵泡。为避免重复计数，只计数有核细胞，每张切片随机选取10个视野，每组8张切片，共80个视野。卵泡分类标准参考Gougeon分级标准[7]。原始卵泡是指单层扁平或扁平与立方混合的颗粒细胞包绕卵母细胞；初级卵泡是指单层立方型颗粒细胞包绕卵母细胞。

卵巢组织PCNA表达检测采用组织学切片的Envision二步法操作测定。每组8张切片，每张切片随机选取10个视野，共80个视野。在光学显微镜下(×200)计数PCNA表达阳性及阴性卵泡数。卵母细胞核呈棕黄色时视为PCNA蛋白表达阳性，PCNA阳性率=(PCNA阳性卵泡数/总卵泡数)×100%。

卵巢组织凋亡检测卵巢组织凋亡检测采用TUNEL法检测，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。凋亡细胞核为棕黄色(包括卵泡及间质细胞)，定义为TUNEL阳性。每组共8张切片，每张切片随机选择3个高倍镜视野图，通过Image-pro Plus 6.0软件计数凋亡细胞[8]。

统计学处理应用 SPSS 24.0统计软件进行统计学分析，4组间卵泡正常形态率、PCNA阳性率采用卡方检验分析；凋亡细胞计数的比较采用单因素方差分析，体外培养雌二醇采用重复测量方差分析，组间比较采用最小显著性差异法。实验数据以均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

体外培养雌激素浓度新鲜组及冷冻复苏各组卵巢组织体外培养9 d，雌激素随时间延长不断增长，冷冻复苏各组与新鲜组雌激素浓度差异无统计学意义(F=0.363，P=0.780)(图1)。

冷冻前后组织形态学HE染色切片显示，各级卵泡在卵巢组织中分布不均，以原始卵泡为主，其次为初级卵泡。各组卵巢组织均存在形态正常的卵泡和闭锁的卵泡，大部分卵泡在冻融后可以维持正常形态。解冻后异常卵泡表现为卵泡形态不规则，颗粒细胞分散、不连续、核固缩等(图2)。4组原始卵泡及初级卵泡形态正常率差异均有统计学意义(P=0.004)；经多重比较并对P值进行校正后显示新鲜组原始卵泡形态正常率明显高于程序化冷冻组、自研载体I玻璃化冷冻组和自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组(P=0.030，P=0.012，P=0.006)，冷冻复苏各组原始卵泡形态正常率差异无统计学意义(P=1.000)；程序化冷冻组初级卵泡正常形态率明显低于新鲜组(P=0.000)，自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组初级卵泡正常形态率与新鲜组比较差异无统计学意义(P=1.000，P=0.972)，程序化冷冻组与自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组初级卵泡形态正常率比较差异无统计学意义(P=0.133，P=0.246)(表1)。

图1 卵巢组织体外培养的雌二醇浓度

卵巢组织PCNA表达结果各组卵巢组织中均可见到PCNA阳性表达(图2)。新鲜组、程序化冷冻组、自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组PCNA阳性表达率分别为17.2%、15.6%、16.7%及16.4%。各组卵泡PCNA阳性表达率之间差异无统计学意义(P=0.949)。

卵巢组织凋亡情况TUNEL反应阳性的细胞计数显示，各组均有不同程度的细胞凋亡，但冷冻细胞凋亡水平比新鲜组明显增加(图2)。冷冻复苏各组细胞凋亡数目明显高于新鲜组(13.88±8.96)(F=37.584，P=0.000)，程序化冷冻组细胞凋亡数目(129.21±51.06)明显高于采用自研载体I玻璃化冷冻组(64.08±37.38)及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组(60.63±40.69)，差异具有统计学意义(F=18.992，P=0.000)。

表1 4组卵巢组织形态学分析(%)

PCNA：增殖细胞核抗原；TUNEL；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记；→：示正常原始卵泡；↑：示正常初级卵泡；↓：示异常原始卵泡；←：示异常初级卵泡；：示PCNA表达阳性的卵泡；：示PCNA表达阴性的卵泡

讨 论

玻璃化冷冻是采用较高浓度的冷冻保护剂减少组织及细胞内水分含量，然后快速冷冻。在非常快的冷冻速率下，与冷冻保护剂混合的水分子无法排列成晶体结构，而是形成一种玻璃化的黏稠状态，减少细胞内外冰晶形成，从而减少细胞冷冻损伤[9- 10]。快速降温是玻璃化冷冻技术减少组织冷冻损伤的关键，而载体选择十分重要。目前玻璃化卵巢冷冻使用的冷冻载体主要有(1)开放式载体：卵巢组织直接与液氮接触，主要有冷冻环、冷冻载杆、细胞筛网、针刺式载体等；(2)封闭式载体：卵巢组织不与液氮直接接触，主要有冷冻袋、冷冻管、麦管等[11- 12]。封闭式载体由于管壁较厚，温度传导慢，大大降低冷冻速率，影响卵巢冷冻效果，且只能冷冻较小的卵巢组织。开放式载体虽然保证了冷冻速率，但是直接与液氮接触可能会造成病原体传播，因此限制了其在临床中的应用。

在玻璃化冷冻中，卵巢组织与液氮直接接触后形成的沸腾氮气包绕在组织周围，其低导热性降低了冷冻速率，从而影响冷冻效果[13]，本研究采用的自研载体Ⅰ为80目304不锈钢金属筛网，自研载体Ⅱ为PET塑料超薄载体片，可有效改善这一不足，大大提高了冷冻速率。本研究显示各冷冻组原始卵泡形态正常率无差异，但是程序化冷冻组初级卵泡形态正常率低于新鲜组，而采用自研载体的玻璃化冷冻组的初级卵泡正常形态率与新鲜组相比差异无统计学意义。Zhou等[14]研究显示，玻璃化冷冻和程序化冷冻对于原始卵泡的保存效果相当，与本研究HE染色结果一致。Shi等[15]对程序化冷冻和玻璃化冷冻效果进行了荟萃分析，结果显示两种方法之间原始的保存效果差异无统计学意义，但是玻璃化冷冻方法对DNA损伤较轻，且对基质的保存效果更好。本研究对各组卵巢组织的凋亡检测提示，采用自研载体的玻璃化冷冻组卵巢组织细胞凋亡率低于程序化冷冻组。这可能是由于卵巢组织中细胞类型多样，包括颗粒细胞、间质细胞等多种细胞类型，不同细胞类型具有不同冰晶点。程序化所采用的冷冻载体系统是冷冻管，将组织置于低浓度冷冻保护剂中，在逐步降温过程中使细胞内逐渐脱水，冷冻保护剂浓度逐渐增加，以防止细胞内冰晶形成，它的缺点是打破了细胞内外的平衡状态，在复温时易出现细胞内液重结晶。玻璃化冷冻采用较高浓度的冷冻保护剂和非常快的冷冻速率，从而减少了细胞内外冰晶的形成，防止组织损伤。Fabbri等[16]和Zhao等[8]的研究显示采用玻璃化冷冻后对卵巢组织间质细胞的保存效果优于程序化冷冻。

本研究显示4组卵巢组织体外培养后雌二醇浓度不断升高，组间差异无统计学意义，表明冷冻复苏过程对卵巢组织的内分泌功能无影响。但是由于卵巢基质细胞也可产生部分激素，所以激素的测定仅能证明冷冻复苏后的卵巢组织仍有活性[17]。PCNA是细胞生长周期中重要的调节因子，标志着卵泡生长的开始，是检测卵泡增殖活性的灵敏指标。研究显示PCNA阳性率新鲜组高于各冷冻组，自研载体玻璃化冷冻组高于程序化冷冻组，但各组之间PCNA阳性率差异无统计学意义，表明冷冻复苏过程并不影响细胞的增殖活性。

综上，两种方法均可以较好保存卵巢的结构及其活性，采用自研载体玻璃化冷冻能更好地保存相对复杂的组织结构，且本研究采用的自研载体系统操作简便、价格低廉，有望成为用于人卵巢组织冷冻的良好载体。虽然羊卵巢与人卵巢相似，但二者卵巢大小、排卵周期及卵泡密度等仍存在一定差异。因此，自研载体应用于人卵巢组织的玻璃化冷冻效果仍需进一步实验证实。