鲤仔鱼耳石上锶标记的持久性评价

邱 晨 ，姜 涛，陈修报 ，刘洪波 ，杨 健 ，

（1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心院长江中下游渔业生态环境评价与资源养护重点实验室，江苏 无锡 214081）

人工增殖放流是一项以养护水生生物资源、修复水域生态环境、促进渔民增收、振兴渔业经济为目标的国策。农业农村部所制定的《2019 年农业农村绿色发展工作要点》也将该工作列为“着力强化渔业资源养护修复”的重要内容。为有效掌握资源鱼类的增殖放流效果，开发及优化放流标记和跟踪评估技术具有十分重要的意义，但同时也是开展经济、珍稀水生生物物种增殖放流及其效果评价工作中的难点课题。

值得注意的是，由于锶（Sr）的代谢与钙（Ca）相似，容易被硬骨组织吸收和保留，且早期生活史阶段的鱼体对 Sr 的吸收和积累效应更明显［1］；因此，Sr 元素被认为可用于仔稚鱼等个体耳石化学标记的安全有效的标记工具［2］，与传统标记技术相比，Sr 标记因其具有操作简单、成本低、对鱼干扰少等优点［3］而备受关注，也已成为研究热点之一。迄今，多种鱼类的耳石 Sr标记已取得了成功［4-11］。

如果创建的标记可以在标志鱼的整个生命周期中存在，那该标志技术的价值就能显著增加［12］。若耳石上所形成的Sr 标记可以永久保存的话，无疑将具有客观地区别于非标记鱼，且评价增殖放流生态效果价值。由于耳石具有代谢惰性，元素一旦被沉积到耳石上，就可能存在于鱼类的整个生活史，不会被代谢或消失，但迄今尚未发现有针对外源Sr 标记在耳石可存留最长时间的研究报道。为此，本研究以鲤（Cyprinus carpio）仔鱼为试验对象，在已证明Sr可以作为其安全有效标记物的基础上［13，14］，对其进行有针对性的高Sr 标记试验，再经过长时间的恢复续养，探究Sr 标记在其3 对耳石（即矢耳石、微耳石和星耳石）上的标记效果及保持情况，并比较筛选出最适合作为长期Sr 标记研究的耳石类型，以期能为破解和评价鲤科鱼类耳石Sr 标记的持久性，更好地发展及优化相关耳石Sr 标记技术提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼于2017 年4 月26 日采自江苏省无锡市中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南区实验基地人工繁殖的健康鲤仔鱼（14 日龄）［15］。试验标记溶液为10 mg/L 六水氯化锶（换算成Sr2+的浓度为3.3 mg/L）（SrCl2·6H2O，分析纯，上海抚生实业有限公司）溶液。

1.2 浸泡标记与检测

1.2.1 试验设计与样本采集方案 标记前，试验鱼在100 cm×45 cm×50 cm 玻璃缸内空腹暂养1 d，以减少标记期间代谢消耗。2017 年 4 月 29 日 17：30，随机挑选300 尾试验鱼（全长为8～10 mm）放入标记溶液中空腹标记2 d，标记期间不断向水体充氧。2017年 5 月 1 日 17：30，将试验鱼分别置于盛有 100 L 曝气自来水的玻璃缸（规格同上）中续养恢复，期间进行正常投喂，每日清理排泄物及换水1 次，换水量占养殖水体的1/4。整个试验不控温度和光周期。

为开展鲤仔鱼耳石上锶标记的持久性探索，从上述试验鱼中选养1 尾，一直恢复续养至2018 年12月29 日（607 d，即20 个月），且于当天17：30 时进行了该鱼的活体取样，并解剖摘取其3 对耳石。

1.2.2 耳石的摘取与检测 在解剖镜下取出鲤鱼3对耳石，即矢耳石、星耳石和微耳石（图1），用去离子水去除耳石表面有机杂质，自然晾干。用环氧树脂（Epofix，Struers 公司）进行包埋，用碾磨机（Disco⁃plan-TS 型，Struers 公司）初、精磨至核心标记，再将其用磨抛机（LaboPol-35，Struers公司）将其抛光至核心完全标记在表面且耳石表面无明显划痕。测定前，耳石样本用去离子水超声清洗，完全干燥后，用真空镀膜机（JEE-420，日本电子株式会社）镀膜（36 A，25 s）。利用X 射线电子探针微区分析仪（EPMA，简称电子探针，JXA-8100 型，日本电子株式会社，下同），分别对3 对耳石（矢耳石和微耳石为过核心的矢状面，星耳石为过核心的横截面）进行定量线和面分布分析［16，17］。

图1 六水氯化锶溶液中浸泡标记2 d 后再恢复续养607 d 时鲤仔鱼及其3 对耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）形态

1.3 数据分析

数据采用Excel 2007 进行汇总及作图。定量线分布数据用Sr 含量和Ca 含量的比值来表示，耳石上不同区域Sr/Ca 比值用平均值±标准差表示，由于耳石中Sr 含量远小于Ca 含量，按惯例将Sr/Ca 标准化，即统一用（Sr/Ca）×103来表示，简称Sr/Ca 比值。

2 结果与分析

电子探针微区分析所获面分布结果显示，经10 mg/L SrCl2·6H2O 标记，再经过长达 20 个月的恢复续养后，鲤仔鱼3 对耳石上呈现出不同的标记特征。微耳石和矢耳石上仍可观察到红色高Sr 含量标记区（图2）。定量线分布结果也证实，星耳石、微耳石和矢耳石上均出现了明显的一个Sr/Ca 比值标记峰，峰值分别9.62、9.53、7.84（图3）。

图2 恢复续养607 d 时鲤仔鱼3 对耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）上的锶标记图谱

图3 恢复续养607 d 时鲤鱼3 对耳石（微耳石、矢耳石和星耳石）从核心（0 μm）到边缘定量线分析所获Sr/Ca 比值图谱

3 小结与讨论

传统标志法，如挂牌法、剪鳍法、染色法等［18］，虽在国际上应用广泛，但都存在标记易丢（消）失或保存率较低的“瓶颈”［19］，而确保标志或标记的持久性是衡量一项放流标志技术价值的重要指标［12，20］。由于耳石Sr 标记的可检测性和持久性，使其具有可获取耳石上精确的标记及其持续保持时间参数的潜力。

鱼类耳石Sr 标记技术的研究是基于耳石代谢惰性这一特性来实现的。王臣等［7］对大麻哈鱼（On⁃corhynchus keta）发眼卵后期胚胎进行不同浓度Sr 浸染试验中，经100 d 恢复续养后，矢耳石上Sr 峰值仍清晰可测，说明Sr 标记在矢耳石至少能存在100 d。Steven 等［21］利用 5 000 mg/L SrCl2标记红大麻哈鱼（Oncorhynchus nerka）鱼苗，恢复续养 21 个月时，其矢耳石上的高Sr 部位能明显被检测到。Morales-Nin 等［22］经 Sr 肌肉注射标记的鲈形目尾斑重牙鲷（Diplodus annularis）和纹首鮨（Serranus scriba）个体在续养277～366 d（近12 个月）后，耳石上均可检测出Sr 标记信号。同样，本研究证实了在鲤仔鱼阶段利用 Sr 溶液 2 d 标记后，经过长达 607 d（20 个月）的续养，3 对耳石上红色高Sr 含量标记环均清晰存在；Sr/Ca 比值标记峰值也非常明显。这说明Sr 均可有效标记鲤星耳石、微耳石、矢耳石三类耳石达640 d以上，具显著的持久性。从Sr 标记图谱区域范围、含量水平和Sr/Ca 比标记峰值综合来看，星耳石能更为清晰地反映Sr标记持久性的效果。

本研究证实即使经过607 d 的长期续养恢复后，其星耳石、微耳石、矢耳石上沉积形成的高Sr含量及高Sr/Ca 比值峰值“标记”区域仍可清晰留存。这种现象的存在显示出耳石Sr标记应该具有明显的持久性，也进一步印证了耳石Sr 标记技术的优势。在此基础上，需要增加相关工作的耳石样本量及加长标记鱼的恢复续养时间，来进一步确认上述标记持久性的普适性，以便为鱼类增殖放流服务和相关基准/标准的研发提供更系统的理论基础和数据支撑。