一株鸭疫里默氏杆菌RA-T株的分离鉴定

刘霞

摘要：2020年9月山东滨州某鸭场内雏鸭陆续发病死亡，根据发病情况初步分析是鸭传染性浆膜炎。经过临床诊断和实验室检测最终确诊为鸭疫里默氏杆菌感染，经过积极治疗，疫情得到有效控制。本研究对该发病鸭场病料开展了实验室相关检验，并成功保存一株命名为RA-T的鸭疫里默氏杆菌。

关键词：鸭；鸭疫里默氏杆菌；RA-T株

鸭传染性浆膜炎俗称鸭疫等，是养鸭业中常发的一种细菌类传染性疾病，其致病菌为鸭疫里默氏杆菌。研究发现鸭疫里默氏杆菌的血清型众多，有21种，但不同血清型之间缺乏交叉保护。当前鸭疫里默氏杆菌病是危害养鸭业最严重的细菌性疾病之一，该病在全世界范围内流行，给养鸭业造成了巨大的经济损失。我国鸭疫里默氏杆菌病也很严重，已有研究报道的血清型多达10种以上，在养鸭过程中对鸭疫里默氏杆菌病的防治存在一定的困难。该病在世界范围内广泛流行，随着季节交替，早晚温差加大，使得近期鸭场各类疾病突增，尤其以鸭疫里默氏杆菌病发病率升高最为明显。2020年9月，山东某鸭场鸭群突然发病，病鸭精神萎靡，不愿走动，眼鼻有浆液性分泌物，下痢且粪便呈黄绿色，濒死鸭多表现头向后背、两脚伸直、摇头等神经症状，发病率和死亡率日益增多。对病死鸭剖检可见肝脏、心脏表面有灰白色纤维素性渗出物覆盖，脑膜充血，气囊壁增厚，呈纤维素性气囊炎。结合临床症状及病理变化初步诊断为鸭疫里默氏杆菌病。本文主要介绍了此次诊治过程的实验室研究内容，以期对其他类似病症的检验给与帮助。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料采集山东滨州某规模养鸭场中病死鸭的鸭头。

1.1.2主要试剂天津康源生物科技有限公司的新生牛血清（批号：20190718），TSA培养基，杭州天和微生物试剂有限公司购买的生化发酵管和药敏片，含5%牛血清的TSA培养基、麦康凯培养基。鸭疫里默氏杆菌PCR检测引物：RA-F：GACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGT，RA-R：TAACTGAGATGGGTTAACACCTCTAGC。

1.2方法

1.2.1病料细菌分离及纯化将采集的病料组织分别划线接种到麦康凯和含5%新生牛血清的TSA培养基上，麦康凯培养基放置在恒温培养箱中，TSA培养基放置在厌氧罐里，37℃培养18h。然后挑取典型的单个菌落划线接种到5%新生牛血清的TSA培养基上，37℃厌氧条件下培养24h。

1.2.2菌体染色及镜檢将分离菌的纯培养物采用革兰氏染色的方法进行染色，并在1，000倍的油镜下进行镜检观察，记录菌体的形态和染色特性。

1.2.3 PCR扩增取疑似鸭疫里默氏杆菌分离菌作为PCR模板，PCR体系为：10μL 2×Taq PCR Master Mix，1μL模板，RA-F 0.5μL，RA-R 0.5μL，补无菌H2O至总体积20μL，同时设立阴性对照组；运行程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10min。PCR反应后取10μL扩增产物加入到1.5%琼脂糖凝胶加样孔中，电泳约25min后，在凝胶成像仪上照相观察。

1.2.4生化试验按照常规方法，对可疑菌纯培养物分别接种葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、过氧化氢及尿素等微量生化鉴定管，然后将各微量生化鉴定管放置到37℃恒温培养箱中培养18h，观察结果。

1.2.5药敏试验将分离菌纯培养物均匀涂布在含4%新生牛血清的TSA培养基上，再分区平贴上卡那霉素、利福平、氨苄西林、链霉素、青霉素、多西环素、磺胺异恶唑、头孢氨苄、阿奇霉素、阿莫西林、新霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素、红霉素、多粘菌素B、头孢噻肟共计18种常用药敏片，在37℃厌氧罐里培养24h，观察抑菌圈的有无及直径大小。

1.2.6分离菌株毒力试验14日龄健康雏鸭10只，分成两组：试验组和对照组，5只/组。试验组雏鸭通过颈部皮下接种0.2mL菌液，含菌量为1×108CFU，对照组雏鸭不做处理。将两组雏鸭分别隔离饲养10d。同时观察各组雏鸭健康情况，如有死鸭需解剖观察病理变化并进行细菌分离。

2结果

2.1分离纯化

麦康凯琼脂培养基上没有菌落生长；在含5%新生牛血清的TSA培养基上出现圆形突起、边缘整齐、不溶血的露珠样菌落，直径约1.5～2mm。斜射光下可呈现淡绿色荧光。

2.2镜检

典型菌落进行革兰氏染色镜检，可见分离菌为无芽胞的阴性杆菌，两端钝圆，多数单个存在，也有少数两个排列或呈短链排列的形态。与鸭疫里默氏杆菌镜检特征相符。

2.3生化试验

该分离菌株与糖类和醇类反应为阴性，可见不与糖类和醇类发生反应，但能够与过氧化氢和尿素发生反应，结果呈阳性。由此可见该分离菌株的生化特性与鸭疫里默氏杆菌相近。

2.4 PCR结果

电泳结果显示，以分离菌株为模板获得的片段大小与预期的鸭疫里默氏杆菌目的片段一致，由此可确定该分离菌为鸭疫里默氏杆菌，将其命名为RA-T。

2.5药敏试验结果

药敏试验结果显示分离株对磺胺异恶唑、头孢氨苄高度敏感，对利福平、丁胺卡那、头孢噻肟中度敏感，对新霉素、多黏菌素B低度敏感，其余11种均不敏感。

2.6动物回归试验结果

试验组雏鸭攻毒24h后陆续出现精神倦怠，呆立不动，蜷缩在角落，食欲下降，拉绿色或灰黄色稀便，头向后背、两脚伸直等症状，48h内全部死亡。对照组雏鸭未见异常，健康生长。24h内死亡鸭解剖后病变不明显，48h死鸭可见心脏、肝脏表面均有明显的纤维素样渗出。取病死鸭的鸭头及肝脏进行细菌分离，均可以分离到鸭疫里默氏杆菌。

3讨论

本研究根据临床症状、病理剖检，并结合细菌分离培养、生化试验及PCR检测等实验操作，成功从山东省某养鸭场病死鸭脑组织中分离出了1株鸭疫里默氏杆菌。本试验选用18种常规用药进行药敏试验，结果显示该分离株对不同药物的敏感程度有所差异，耐药性也比较严重，分析原因可能与日常养殖过程中抗生素的长期不合理使用有关。在临床防治鸭疫里默氏杆菌时，根据药敏试验结果合理选用药物，同时交替使用2～3种敏感药物，不仅可以取得良好的治疗效果，也可以避免药物耐药性的产生。随着人们对食品安全的重视，养鸭业中抗生素的使用逐渐受到限制。耐药性分析是在防控中用药治疗的依据，合理规范使用抗菌素在一定程度上可以避免耐药性的产生。因此在鸭疫里默氏杆菌病临床诊治中进行分离鉴定和对其药敏性的研究至关重要。

调查发现随着天气逐渐变凉，昼夜温差加大，近期鸭场多种疫病发病率持续升高。鸭疫里默氏杆菌病的发病与鸭场卫生条件状况及饲养方法有很大关系，该养殖场内养殖密度过大，加之近期阴雨天气的影响，地面潮湿，通风差，进而导致了此次疫情的发生。从病料分离的致病菌来看，鸭疫里默氏杆菌病发病率约占74%。由于鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病两者在剖检变化等方面极为相似，应予以区别。通常大肠杆菌病不出现全身抽搐、角弓反张等神经症状，剖检后肠道病变更明显，两者都可以形成肝脏表面的纤维素渗出物，但鸭疫里默氏杆菌病形成的更薄、更干燥、更易剥离。

鸭疫里氏杆菌病对养鸭业危害极大。恶劣的饲养环境、不科学的养殖方式是诱发鸭疫里氏杆菌病的重要因素，因此在养殖过程中，一定要加强饲养管理，采取合理的饲养密度，保持适宜的温湿度，保持空气的充分流通，一旦发病，及时隔离诊治。目前预防鸭疫里氏杆菌最有效的方法是科学制定免疫程序，选用安全有效的疫苗，对鸭群接种鸭疫里氏杆菌类疫苗，使鸭群产生免疫抗体，来抵御疾病的发生。鸭疫里氏杆菌油佐剂灭活疫苗免疫9日龄左右雏鸭，免疫14d后对鸭群进行二免，通常免疫效果较好。█