鸭肠炎病毒gD蛋白亚细胞定位及其对病毒感染相关作用分析

张杨子 王璇 吴玙彤 潘淑惠 文正常 文明

摘要：本试验旨在研究鸭肠炎病毒（DEV）gD蛋白亚细胞定位及其对病毒感染的相关作用。本研究经过对DEV病毒扩增处理，利用原核表达系统获得重组gD基因胞外区蛋白（gDw），以兔抗gDw IgG为抗体，进行免疫荧光反应，对比病毒对照组，检查gD蛋白在吸附、侵入以及传播之间起到的作用。结果表明，经过荧光显微镜观察，接种DEV后4h可见绿色荧光，主要在细胞核附近。持续观察6～24h发现荧光随着时间增加明显加强，细胞轮廓清晰，主要存在于胞浆中。激光显微镜下观察接种DEV后4h可观察到绿色荧光，经过PI染色12h后可见绿色荧光更加明显，主要在胞浆中呈现，在胞核内没有出现特异性荧光。染色后72h可在细胞膜上观察到绿色荧光，且轮廓清晰。添加兔抗gDw IgG不会影响病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未产生明显作用。观察组吸附率和噬斑数与对照组有显著差异（P<0.05），添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直径明显减小，证实了在DEV细胞之间传播过程中糖蛋白D起到抵抗作用。DEF感染DEV后2h可检查到gD基因转录，经过免疫荧光实验，4h后可合成gD蛋白，出现在核膜和核周，12h出现在胞浆上，72h出现在细胞膜上。DEVgD参与病毒侵入以及细胞之间传播的作用，对于病毒吸附不明显，添加gDw Igw抗体后，细胞病变具有延迟反应。

关键词：鸭肠炎；病毒gD蛋白；亚细胞定位；病毒感染作用

鸭肠炎即鸭瘟，是由鸭肠炎病毒（DEV）引发的禽类感染传染病，具有较强的传染性，发病急，死亡率高[1]。一般情况下，禽类感染潜伏期约为3～5d，患病鸭表现出爱独处，头颈卷缩，双脚麻痹，羽毛松乱，不愿意行走。随着病情恶化开始腹泻，排泄物呈白色或绿色，有腥臭味，食欲减退、肛门红肿[2]。经过解剖，患鸭出现体腔积血以及组织出血，存在器官坏死。gD蛋白亚细胞是病毒传播的重要蛋白，具有中和病毒作用，作为一种中和抗原，能够诱导保护反应，鸭肠炎疫苗就是通过将病毒结构蛋白作为抗原免疫，从而达到预防作用。通过研究gD蛋白定位和感染病毒作用，能够实现鸭肠炎的预防和治疗。

1资料与方法

1.1实验材料

采购10日龄左右的鸭胚，制备鸭胚成纤维细胞（DEF）[3]。采购鸭肠炎病毒弱病株。准备分子生物学试剂以及生化试剂。准备DMEM细胞培养基、低熔点琼脂糖。配置PBS缓冲液、甲醇固定液以及碳酸盐缓冲液等。

1.2方法

1.2.1 gD蛋白亚细胞定位根据gD基因序列，收集不同感染时间的DEF，并取正常细胞为对照组。提取RNA，经过酶处理后，进行PCR扩增反应，将产物电泳处理。将DEV接种在载玻片上，接种1、2、4、6、12、24、72h后收获细胞。使用PBS溶液进行单层细胞的冲洗，同时使用多聚甲醛进行固定处理，重复冲洗3次。使用PBS溶液处理细胞。冲洗后使用羊抗兔IgG孵育1h，用PI染色液染色处理，再次用PBS冲洗，固定在载玻片上，进行显微镜观察。

1.2.2 gD蛋白对病毒的感染作用

1）吸附作用。将病毒溶解于DMEM（无血清）、兔抗gDw IgG、兔阴性血清中，接种单层DEF，处理2h去除接种物，使用PBS进行冲洗，将没有结合的游离粒子冲洗干净。在37℃条件下进行培养，对照组不需进行冲洗，直接覆盖低熔点琼脂糖。

2）侵入作用。将病毒溶解于DMEM（无血清）、兔抗gDw IgG、兔阴性血清中，在37℃条件下进行处理1h，丢弃接种物。对照组使用PBS溶液进行清洗，观察组使用醋酸盐缓冲液进行冲洗，经过2min处理后，侵入粒子完全灭活。

3）傳播作用。使用半固体营养琼脂充分吸收释放病毒粒子，DEV通过细胞之间直接传播形成噬斑。用病毒进行接种，然后覆盖有DMEM的营养琼脂经过培养后形成噬斑。进行染色处理后，测量噬斑直径。观察组中含有兔抗gDw IgG。

1.3统计学方法

采用SPSS 23.0软件处理数据，使用t检验计量资料，结果以平均值±标准差表示；使用卡房检验计数资料（%），P<0.05视为差异有统计学意义。

2结果

2.1 gD蛋白亚细胞定位

经过荧光显微镜观察，正常DEF在激发光下没有发现特异性荧光，经过PI染色后呈红色，可见椭圆形清晰轮廓。接种DEV后4h可见绿色荧光，主要在细胞核附近。持续观察6～24h发现荧光随着时间增加明显加强，细胞轮廓清晰，主要存在于胞浆中。激光显微镜下没有观察到DEF出现特异性绿色荧光。观察组接种DEV后4h可观察到绿色荧光，经过PI染色12h后可见绿色荧光更加明显，主要在胞浆中呈现，在胞核内没有出现特异性荧光。染色后72h可在细胞膜上观察到绿色荧光，且轮廓清晰。

2.2病毒gD蛋白对病毒吸附前后噬斑的变化

观察组处理后噬斑（64.71±2.54）个，吸附率（71.29±1.34）%。2组对比，无明显差异。具体结果详见表1。

2.3病毒gD蛋白对病毒侵入前后噬斑的变化

观察组处理后噬斑（51.56±1.70）个，侵入率（65.12±2.31）%。两组对比，差异显著（P<0.05）。具体结果详见表2。

2.4病毒gD蛋白对细胞间传播前后噬斑的变化

观察组噬斑直径（1.25±0.06）mm。两组对比，差异显著（P<0.05）。具体结果详见表3。

3讨论

gD是病毒囊膜的重要构成部分，对病毒侵入细胞有重要意义，负责病毒包膜的融合和病毒释放与扩散的介导作用。在病毒复制和中和抗体中gD也产生重要作用，是体液免疫、宿主细胞免疫的重要靶标。若病毒缺少gD基因，无法和细胞膜发生吸附作用，将造成病毒失去感染能力[4]。在病毒基因组中有至少80多个基因产物，但合成gD主要出现在病毒感染的早期，在DNA复制后合成，当病毒复制活跃后，6～12h开始大量聚集。通过免疫荧光技术可观察到感染4h后gD在核周囊泡上定位[5]。本研究也显示，经过荧光显微镜观察，正常DEF在激发光下没有发现特异性荧光，经过PI染色后呈红色，可见椭圆形清晰轮廓。接种DEV后4h可见绿色荧光，主要在细胞核附近。持续观察6～24h发现荧光随着时间增加明显加强，细胞轮廓清晰，主要存在于胞浆中。使用激光显微镜进行观察，没有观察到DEF出现特异性绿色荧光。观察组接种DEV后4h可观察到绿色荧光，经过PI染色12h后可见绿色荧光更加明显，主要在胞浆中呈现，在胞核内没有出现特异性荧光。染色后72h可在细胞膜上观察到绿色荧光，且轮廓清晰。可见gD定位表现出动态变化过程，和gD发挥功能以及DEF增殖存在密切关联性。在感染后4～6h为糖蛋白合成的活跃时期，从核膜向胞浆上转移，显微镜可观察到绿色荧光增加。感染24h后gD大量合成，胞浆内病毒数量增加，向胞外释放。在72h后观察到细胞膜上出现明显绿色荧光。

经本试验研究，添加gD抗体后会延迟DEV病变的发生，病变局限在少数细胞中，无法形成大范围噬斑，也证明了DEV感染过程是一个膜融合的过程。本研究显示，添加兔抗gDw IgG不會影响病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未产生明显作用。主要对病毒侵入和细胞之间感染产生抑制作用。gD并不会锚定包膜上，gD抗体中和病毒会造成病毒gD数量减少，从而影响病毒的侵入以及传播，最终造成病变延迟。本研究也显示，观察组处理后噬斑（51.56±1.70）个，侵入率（65.12±2.31）%。观察组与对照组对比，差异显著，证实观察组吸附率和噬斑数和对照组有显著差异，添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。观察组与对照组对比，差异显著。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直径明显减小，证实了在DEV细胞之间传播过程中糖蛋白D起到抵抗作用。目前关于gD蛋白的基因研究还相对较少，未来还需要针对gD亚单位疫苗、gD核酸疫苗展开研究，从而有效预防和治疗鸭肠炎。

4小结

综上所述，DEF感染DEV后2h可检查到gD基因转录，经过免疫荧光试验，4h后可合成gD蛋白，出现在核膜和核周，12h出现在胞浆上，72h出现在细胞膜上。DEVgD参与病毒侵入以及细胞之间传播的作用，对于病毒吸附不明显，添加gDw Igw抗体后，细胞病变具有延迟反应。█

参考文献：

[1]张旭，郑敏，吴征卓，等.鸭肠炎病毒感染对鸭十二指肠转录组的影响[J].动物医学进展，2020，41（10）：73-79.

[2]杨霞，蒲翠敏，胡安东，等.鸭肠炎病毒感染对鸭肠道菌群多样性的影响[J].中国预防兽医学报，2020，42（8）：772-778.

[3]张旭，吴征卓，姚碧琼，等.鸭肠炎病毒感染对鸭肠道黏膜组织转录组变化分析[J].基因组学与应用生物学，2020，39（5）：1972-1981.

[4]毛娅卿，张兵，王团结，等.UL56基因下游3513bp对鸭肠炎病毒生物特性的影响[J].中国农业科学，2019，52（23）：4390-4397.

[5]孙莹，张兵，李岭，等.表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建[J].中国农业科学，2019，52（23）：4398-4405.