甘肃某冶炼厂区土壤重金属铅、镉污染特征及其对微生物群落结构的影响

陈任连，蔡茜茜，周丽华*，袁勇，余震，王跃强

1. 广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006；2. 广东工业大学环境科学与工程学院，广东 广州 510006；3. 广东省科学院生态环境与土壤研究所/华南土壤污染控制与修复国家地方联合工程研究中心/广东省农业环境综合治理重点实验室，广东 广州 510006

工农业的快速发展和城市化进程的加快，带来了日趋严重的环境污染问题。土壤是污染物主要的汇集地，重金属作为普遍的污染物（Yin et al.，2019），土壤是其最终的承受者。当土壤重金属浓度超过其阈值水平时，会对所有生命形式产生生理、生化和遗传毒性，而微生物群落的变化是最简单、最直接的表现形式（Jacob et al.，2018）。重金属污染会极大的影响微生物的形态和细胞代谢，从而导致生物多样性的降低（Xavier et al.，2019）。铅（Pb）、镉（Cd）是两种常见重金属，相关环境风险较高，对土壤健康造成严重威胁。暴露于高浓度水平的Pb、Cd可能会损害生物的肝脏、心血管、肾脏和生殖系统等（Du et al.，2020；Hill et al.，2020）。国际癌症研究机构已将Cd归到I类致癌物质行列（Mitkovska et al.，2020）；世界卫生组织将Pb、Cd列入对人类健康最有害的10种毒性物质之中，两者分别排在第2和第7位（Awadalla et al.，2020）。因此对Pd和Cd污染土壤的修复需要引起足够的重视。

在土壤元素的生物地球化学循环过程中，微生物参与并影响重金属的迁移与转化，扮演着不可或缺的角色（Pan et al.，2020）。已有报道指出，在生物修复过程中，微生物可重新分布Pb和Cd的形态并降低两者在土壤中的植物利用率（Li et al.，2016）。不同微生物对不同类型、不同浓度的重金属的耐受性不同，这与它们独特的细胞结构和相关功能有关（Li et al.，2019）。相应地，微生物多样性以及代谢活性容易受到重金属的影响，尤其是活性形式的重金属组分。在重金属胁迫下，能更好地适应和耐受重金属离子毒性的菌株逐渐取代了对重金属敏感的微生物（Yin et al.，2019）。这类适应重金属污染的土著微生物群落在重金属污染物的生物修复中起着关键作用。环境变化时微生物群落表现出高度的敏感性，被认为是当地环境状况的重要指标（Chen et al.，2018）。因此，对土壤重金属污染情况和微生物多样性和群落结构变化的分析，可为重金属耐受菌的鉴定和分离提供理论支撑和土壤重金属污染的生物修复提供技术支持。

目前，关于金属对微生物多样性和丰度的影响尚未达成共识（Narendrula-Kotha et al.，2017）。越来越多的研究旨在填补关于土壤微生物群落对金属暴露的反应及其在不同生态系统中一致性的理解方面的认知，探究可用于评估修复过程的微生物指标（Schneider et al.，2017）。本文以甘肃省白银市某重金属污染厂区周边土壤作为研究对象，阐明重金属长期污染的土壤中微生物群落结构和多样性在污染中心距离尺度上的演替情况。本文对土壤微生物群落的进一步研究可以帮助理解生态系统中的微生物功能以及对重金属污染的耐受性，为土壤微生物修复重金属提供更多有效信息。

1 材料与方法

1.1 样品收集与处理

甘肃省白银市矿产资源较为丰富，是一个典型的工业城市。城市在发展初期环保设施几乎空白，导致Pb、Cd金属的泄露，使土壤Pb、Cd含量严重超标（卜静等，2019）。当地年均气温6—9 ℃，年均降雨量180—450 mm，属于典型的干旱与半干旱型气候；土壤类型主要为发育在不同母质上的灰钙土（李有文等，2017）。2020年8月，从白银市某污染场地（36°61′N，104°22′E）附近采集污染土壤样品，分别来自污染区边缘花坛土、山坡土、石头山沙土和距离污染区较远的对照组土壤，与污染中心的距离分别为5、50、50和3000 m，分别命名为S1、S2、S3和S4。对于每个采样点，采用5点混合采样法，随机收集 5个表层土壤样品（0—20 cm），然后将这5个样品均匀混合成一个复合样品（张雪晴等，2016）。将收集到的土壤样品密封于采样袋中，随后进行实验前处理。将每个土壤样品分为两部分，一部分直接在-80 ℃条件下储存，待DNA提取和高通量测序。另一部分自然晾干，研磨后，过2 mm筛网进行均质，然后存放于4 ℃条件下，待进行土壤理化性质分析。所有试验数据的获取，每个样品均进行3次重复。

1.2 土壤理化性质分析

将土壤样品置于105 ℃烘箱，烘干至恒质量来计算土壤含水率（MC）（Rodríguez et al.，2009）；土壤pH值使用pH计测量，土壤样品以1∶2.5的土壤∶水（m/V）进行提取；土壤电导率（EC）采用电导率分析仪测定，在蒸馏水和土壤（5∶1）溶液中保持恒定搅拌15 min并离心过滤后测量；土壤有机碳含量（TOC）按照 TOC分析仪的固体模块方法；土壤的总磷（TP），总钾（TK）以及Pb和Cd含量使用电感耦合等离子体发射光谱仪 ICP-OES来分析。

1.3 土壤重金属提取及污染评价

重金属的毒性主要取决于其存在形式，特别是可生物提取的活性组分。根据改进的顺序萃取法（European Community Bureau of Reference，BCR）（Huang et al.，2012），对土壤Pb，Cd的不同组分进行提取，可确定为4种馏分：弱酸可提取态（用F1表示）、可还原态（用F2表示）、可氧化态（用F3表示）与残渣态（用F4表示）。提取剂分别为0.11 mol·L-1的醋酸、0.5 mol·L-1的盐酸羟胺、双氧水及 1 mol·L-1的乙酸铵溶液，残渣态的提取采用HNO3/HF/HCl混酸微波消解。每个提取阶段获得的上清液通过0.45 μm膜过滤于50 mL容量瓶中定容，通过原子吸收光谱（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS）进行测量。

采用Hakanson提出的潜在生态风险指数（Risk Index，RI）对采样点土壤进行Pb、Cd重金属污染水平及生态风险等级评估（Hakanson，1980）。Pb、Cd的富集程度和生态毒性系数是本文计算生态危害指数的主要依据，根据潜在生态风险指数划分Pb、Cd的潜在危害程度。由以下公式计算RI：

RI为Pb、Cd综合潜在生态风险指数；Er为重金属的潜在生态风险系数；Tr为重金属元素的毒性系数（Pb=5，Cd=30）；Cr为样品背景值；Cd为样品实测值。Er和RI值越大，Pb、Cd潜在生态风险越高。

1.4 土壤DNA提取和群落分析

通过高通量测序技术对土壤微生物群落进行分析。土壤样品DNA提取具体参照PowerSoil试剂盒的使用说明书进行。使用引物 341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和 805R（GACTACH VGGGTATCTAATCC）扩增 16S rRNA基因的 V3—V4高变区。利用blastn将所获序列与对应数据库进行比对，统计各样本的群落组成。

1.5 数据统计分析

使用 SPSS软件对数据进行统计分析，利用Pearson相关系数来确定土壤性质与细菌群落之间的关联，r值反映相关程度，0.2＜|r|＜0.4为低相关，|r|＞0.8为高度相关，显著性水平P取0.05。通常使用排序的方法来对群落的连续分布进行研究。常用的限制性排序方法包括：冗余分析（Redundancyanalysis，RDA）与典范对应分析（Canonical correspondence analysis，CCA）。将数据导入Canoco 4.5软件后，先进行去趋势对应分析（Detrended correspondence analysis，DCA）得到排序轴梯度长度，若4个轴梯度中最大值超过4，选择单峰模型（CCA）比较合适，若小于3则选择线性模型（RDA）比较合适。结果显示：门水平下梯度最大值为0.731，属水平下梯度最大值为2.698，均小于 3，因此在细菌群落门水平和属水平上分别进行RDA分析。

2 结果与讨论

2.1 土壤性质和重金属污染状况

采样土壤的理化性质和重金属含量如表1所示。可能受植被的影响，S2和S3的土壤TOC含量较S1和S4低。S1处pH值为6.62，其他采样点均偏中性且pH值都接近7.50。S1有着最高的MC和EC，S3的K、P含量最高，S4含有较高的TOC。这些参数的差异可能是影响土壤微生物群落的重要因素（Wang et al.，2018；Chen et al.，2020；Araujo et al.，2020）。

表1 土壤的理化性质和重金属含量Table 1 The physiochemical properties and concentration of heavy metals in contaminated soil

甘肃省土壤重金属元素背景值的调查分析显示，Pb背景值为18.59 mg·kg-1，Cd背景值为0.10 mg·kg-1（王生朴等，1993）。S1—S4采样点的 Pb、Cd含量远超甘肃省土壤背景值，其中 S1的 Pb、Cd污染最严重，Pb含量为 1.83×104mg·kg-1，超出甘肃省土壤Pb背景值的983倍，Cd已高达580.02 mg·kg-1，约是背景值的5800倍。根据潜在生态风险指数评估，S1—S4 采样点的Er＞320，RI＞1200，均达到了极高污染风险程度，且危害程度S1＞S3＞S2＞S4。表明该冶炼厂附近环境受到极其严重的Pb、Cd污染，该区域的土壤生态环境遭受巨大威胁，迫切需要采取有效手段加快该地重金属污染场地治理。

一般来说，重金属的弱酸可提取态（F1）和可还原态（F2）相对于可还原态（F3）和残渣态（F4）更易被生物吸收，F1和F2的总和是生物可利用的馏分，属于生物有效态（Chen et al.，2021），这些有效态重金属可穿透细胞膜，对微生物施加压力，从而致使微生物群落结构和功能发生变化（Liu et al.，2018）。因此，它们对微生物群落更易造成负面影响。通过采用BCR法对土壤中的Pb、Cd不同形态进行提取，我们发现土壤中 Pb的主要形态为F1和F2，Cd则主要以F1形态存在（图1）。

图1 采样点重金属及组分分布Fig. 1 Concentrations and components of heavy metals in sampling point

2.2 微生物多样性及组成分析

群落生态学可以通过Chao1指数和ACE指数、Shannon指数和Simpson指数分别反映微生物群落的丰度和多样性。由表2可知S2的细菌丰度及多样性最低，但S2的重金属污染程度并不是最严重，该处细菌群落结构还可能受到其他因素的影响，其他 3个采样点细菌丰度和多样性为 S1＜S3＜S4，与Pb、Cd的污染程度大致呈负相关。对微生物群落组成进行进一步分析，选取每个样品在门水平上最大丰度排名前10，属水平上最大丰度排名前15的物种，生成物种相对丰度柱形累加图（图2）。可看出在门水平上（图2a），4个采样点的微生物群落组成基本一致，但属水平上（图2b）优势菌种存在较大的差异，Phenylobacterium，Aquabacterium和Chitinophaga在S2大量存在。

图2 土壤细菌群落组成分析（a）门水平，（b）属水平Fig. 2 The composition of the microbial community at the phylum level(a) and the genus level (b) of contaminated soils

表2 采样点的多样性指数Table 2 Phylotype richness and diversity estimates of the bacterial communities in sampling points

在门水平上，4个采样点中 Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和Firmicutes门丰度最高，占细菌总数的69.28%，相对丰度分别为32%、21%、12%、5%，这与多数重金属污染环境中观察到的群落组成一致。Zhao et al.（2019）、Li et al.（2020）和Ma et al.（2020）发现在铅锌冶炼厂或其他重金属含量很高的金属冶炼厂周围地区，微生物群落通常也以 Proteobacteria，Firmicutes，Actinobacteria，Bacteroidetes和 Acidobacteria门为优势种群。Xiao et al.（2019）发现尾矿堆的土壤样品中，在门水平上Proteobacteria和Firmicutes明显丰富。在受到铅锌和金矿开采废物污染的田间土壤中，Proteobacteria，Acidobacteria，Bacteroidetes，Actinobacteria，Gemmatimonadetes，Firmicutes占据大部分比重（Guo et al.，2017）。

在属水平上，4个采样点分布比较广泛的菌种是Sphingomonas、Gemmatimonas、Ohtaekwangia和Rubrobacter，它们的相对丰度约占总数的11.29%，分别为 5.96%，2.03%，1.65%，1.65%。在重金属污染的土壤中，Sphingomonas是Proteobacteria门中最丰富的属，在重金属污染较为严重的样品中发现Sphingomonas分布广泛，且丰度最高（蔡茜茜等，2018）。在 Sb、As污染的稻田土壤中，检测到了Sphingomonas和Gemmatimonas的富集（Li et al.，2020）。Ohtaekwangia在煤矿污泥中被检测为主要属（Ma et al.，2015）。Gemmatimonas在有色金属污染的地区也得到了鉴定（Liu et al.，2018）。

2.3 影响土壤微生物群落结构的因素分析

2.3.1 土壤性质与微生物群落结构相关性分析

土壤理化性质变化也会引起微生物群落结构变化。虽然土壤pH值是影响细菌群落结构的关键性因素（Marcin et al.，2013），而本文中4个采样点的pH值相差甚小，可能不是影响微生物群落结构的主要因素。通过确定各项参数之间的 Pearson相关系数，来确定土壤理化因子与微生物群落之间的关系。在门水平上，MC与 Bacteroidetes和Firmicutes显著正相关（r值分别为0.979和0.994），TK与Actinobacteria显著正相关（r=0.961）。属水平上，MC与Acidiferrobacter显著正相关（r=0.951），TP与Ohtaekwangia显著正相关（r=0.968），Chen et al.（2020）表明通过添加富含P的生物炭可以对细菌进行保护作用。尽管有其他研究表明土壤TOC，EC对微生物群落结构影响强烈（Liu et al.，2018；Zeng et al.，2020），在本文的研究样品中未观察到有明显相关性。

2.3.2 重金属与微生物群落结构相关性分析

通过重金属与细菌群落之间的 pearson相关系数以及 RDA分析，预测重金属和土壤细菌群落之间的关系。RDA分析结果中从二维排序图上可直观获得重金属、样本及菌种三者之间的关系。在RDA图上（图3），红色箭头代表重金属，蓝色圆圈代表样本，黑色箭头表示不同物种。线的长度指示该因素导致的差异性程度，环境因子箭头连线长度越长表示该环境因子与样本分布之间的相关度越大。物种箭头指向与环境因子箭头同向表示高度正相关（物种线越长，关系越强）（Zhu et al.，2013）。RDA分析获得的环境变量对微生物丰度差异性解释量如表3和表4所示。门水平上，第一轴对物种数据的解释量为75.4%，前两个排序轴对物种的解释变量为 89.5%。第一排序轴与 Pb、Cd、APb和ACd的相关系数分别为-0.8923、-0.7297、-0.9066和0.8240，具有较高的相关性。第二排序轴与TCd相关系数为-0.6793。在属水平分析中，第一轴对物种数据的解释量为55.5%，前两个排序轴对物种的解释变量占89.7%。第一排序轴与APb相关系数为0.6255，第二排序轴与Pb、Cd、APb和ACd的相关系数分别0.9542、0.9471、0.6886和-0.7243，相关性较好。上述分析结果表明，重金属的含量和重金属活性组分对物种群落具有较大影响。

图3 在门水平（a）和属水平（b）上分析重金属、细菌群落和样本之间的相关性Fig. 3 Redundancy analysis (RDA) of sampling point and microorganisms and heavy metals at the phylum level (a) and the genus level (b)

表3 重金属对微生物差异性解释变量冗余分析Table 3 RDA of heavy metals and microorganisms

表4 重金属与排序轴的相关性Table 4 Correlationship between soil heavy metals and the environmental axes

重金属污染在一定程度上会影响微生物丰度和多样性（Ding et al.，2017；Song et al.，2019）。Liu et al.（2018）发现Proteobacteria的分布与Cd和Mn呈负相关。微生物群落也会对环境变化做出反应，土著微生物群落可能已经进化出在不利环境中生存的策略，Li et al.（2020）表明微生物对Sb和 As浓度的升高具有耐受性。在重金属暴露期间敏感种群逐渐减少，可忍受高浓度重金属的菌种逐步占主导地位，从而限制了其他敏感性细菌的繁殖。Proteobacteria，Actinobacteria，Firmicutes与Chloroflexi被确定为被金属污染的土壤中最主要的菌群，它们可能对重金属离子耐受方面发挥至关重要的作用（Zeng et al.，2019；Jacquiod et al.，2018；Zhang et al.，2018）。Schneider et al.（2017）在对比土壤中细菌群落对 Pb冶炼厂污染的响应研究中发现，在高污染水平下，Proteobacteria含量更高。Actinobacteria和Acidobacteria可以耐受高浓度的总Cd和Zn和可生物利用的锌（Ali et al.，2020）。我们在 S1—S4 4个采样点中均检测到了丰富的Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes 和Firmicutes菌。土壤总铅含量（TPb）与Bacteroidetes和 Firmicutes显著正相关（r值分别为 0.995和0.983），总镉含量（TCd）与Acidiferrobacter属显著正相关（r=0.979），与RDA分析结果一致。这有可能是源于这些细菌中的某些物种含有丰富的重金属抗性基因，这有助于它们适应高浓度的金属污染（Yan et al.，2020；Chen et al.，2018）。

重金属对土壤微生物的毒性与重金属的生物利用度直接相关，重金属的生物有效态易被吸收，环境危害大，对群落组成造成较大的影响（Zeng et al.，2019）。生物有效态铅（APb）与Actinobacteria和 Acidobacteria呈显著负相关（r值分别为-0.987和-0.980），与Rubrobacter显著负相关（r= -0.990）。生物有效态镉（ACd）与Actinobacteria显著正相关（r=0.951），与Sphingomonas显著正相关（r=0.969），这些结果均可在 RDA图上得到验证。已有研究表明Sphingomonas是Cd耐受菌属（Li et al.，2020），也是一种促进植物生长的内生菌，在生物能源作物的生长中起着至关重要的作用，可促进植物对 Cd的耐受性（Zeng et al.，2019）。Sphingomonas对Cd和Pb具有生物修复潜力，被认为是潜在的生物修复剂，在环境保护方面具有更大的潜力（Li et al.，2020）。土壤中 Cd的形态分布通常是可交换态＞可还原态＞可氧化态＞残渣态，且可氧化态和残渣态较为稳定。在酸性较强的S1中发现Cd的氧化态含量比可还原态含量高，推测可能是Sphingomonas等耐性菌促进采样点附近植物对Cd的吸收（Chen et al.，2012；Zeng et al.，2019）。属水平上除Sphingomonas外，Gemmatimonas，Ohtaekwangia和Rubrobacter在采样点S1，S3和S4丰度也比较大。Phenylobacterium，Aquabacterium和Chitinophaga则成为了采样点 S2的优势菌。Gemmatimonas和Ohtaekwangia在重金属污染中普遍存在（Radziemska et al.，2021），Gemmatimonas对重金属具有高度耐受性（Li et al.，2020），Guo et al.（2017）发现在重金属污染的农田中Gemmatimonas与可交换态的 Pb、Cd呈负相关。Ohtaekwangia丰度随土壤中金属基纳米颗粒增加而增加，对重金属具有一定耐受性（Shi et al.，2020）。在混合污染土壤中发现了Rubrobacter，并与重金属 Cu、Pb和 Zn相关（Khudur et al.，2018）。

上述结果表明，土壤性质和重金属污染共同影响着土壤微生物群落。该冶炼厂导致的Pb、Cd重污染土壤存在较高丰度的 Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和Firmicutes耐受重金属菌门，与多数重金属污染场地的微生物群落研究结果一致，推测重金属污染可能定向改变了土壤细菌群落结构。

3 结论

本文探究了白银市某厂区周围长期受到 Pb、Cd污染的土壤中微生物群落多样性的变化，分析了土壤性质和重金属污染对微生物群落的影响。

（1）土壤污染评价：S1—S4采样点的生态风险均已经达到了极高污染风险程度，总体环境受到极其严重的 Pb、Cd污染。其中 S1土壤 Pb含量为1.83×104mg·kg-1，超出甘肃省土壤Pb背景值的983倍，Cd含量已经高达580.02 mg·kg-1，约是背景值的5800倍，显示该区域土壤生态环境遭受巨大威胁，且危害程度S1＞S3＞S2＞S4。BCR顺序提取结果显示，土壤中 Pb的形态主要为弱酸可提取态和可还原态，Cd则以弱酸可提取态为主。

（2）群落结构及相关性分析：采样点 S2的细菌丰度及多样性最低，其他3个采样点细菌丰度和多样性为S1＜S3＜S4。在门水平上，Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和 Firmicutes丰度最高。MC与Bacteroidetes和Firmicutes显著正相关；TK与 Actinobacteria显著正相关；土壤总铅含量（TPb）与Bacteroidetes和Firmicutes显著正相关；生物有效态铅（APb）与 Actinobacteria和Acidobacteria呈显著负相关；生物有效态镉（ACd）与 Actinobacteria显著正相关。属水平上，MC与Acidiferrobacter显著正相关；TP与Ohtaekwangia显著正相关；总镉含量（TCd）与Acidiferrobacter属显著正相关；生物有效态铅（APb）与Rubrobacter显著负相关。还检测到Sphingomonas，Gemmatimonas，Ohtaekwangia和Rubrobacter等菌落，它们均对重金属具有较好的耐受性。土壤性质及重金属污染共同影响着微生物群落结构。