腺苷酸活化蛋白激酶α在高血糖大鼠急性创面再上皮化过程中的表达

王治兵，徐秋燕，王宝宏，张艳冰，曹露莹，马 凯，侯绍章，董俭达

（1.宁夏贺兰县人民医院，贺兰 750200；2.宁夏医科大学临床学院，银川 750004；3.宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川 750004）

中国是目前糖尿病患者最多的国家[1]。我国因慢性创面住院的患者，其中糖尿病相关创面达32.6%[2]。早期发现糖尿病慢性难愈创面的危险因素，积极干预急性创面延迟愈合（delayed wound healing，DWH）的问题，对预防糖尿病足等慢性难愈性创面的发生具有关键作用[3-4]。再上皮化障碍（re-epithelialization disorder，RED）是DWH的关键事件，与DWH恶化及慢性难愈性创面发生密切相关[3-4]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞内重要的能量感受器，在糖尿病发生和发展中具有重要作用[5]。有研究[6]发现AMPK的激活剂二甲双胍对糖尿病创面愈合有促进作用，其机制尚不清楚。本研究通过建立高血糖大鼠模型，制备大鼠皮肤急性创面，利用二甲双胍局部处理创面，动态观察AMPKα其创面再上皮化（re-epithelialization，RE）区角质形成细胞（KCs）中的表达，为糖尿病创面DWH的机制研究提供实验线索，为糖尿病创面临床治疗提供潜在的靶点。

1 资料与方法

1.1 材料及仪器

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30只，体质量150～160g，由宁夏医科大学实验动物中心提供［Ⅰ级动物，合格证编号SCXK（N）2015-0001］。链脲佐菌素（STZ，Sigma公司，美国），盐酸二甲双胍肠溶片（批号：148880484；天安药业股份有限公司），血糖测试仪（博仕珑，GLM-7911W，中国），皮肤取样器（皮肤环钻，直径5 mm，Acuderm公司，美国），小鼠单克隆IgG2a（kappa轻链）AMPKα1/2抗体（克隆号：D-6；Santa Cruz公司，美国），ABC试剂盒为VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit（Peroxidase，Mouse IgG）（PK-6102），ImmPACT DABPeroxidase（HRP）Substrate（SK-4105），均购自美国Vector Laboratories公司，苏木素-伊红试剂（DH0006，Leagene公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和高血糖大鼠制备 实验大鼠随机分为正常血糖对照组（NC）、高血糖组（DC）、高血糖二甲双胍干预组（DM），每组10例。饲养于宁夏医科大学实验动物中心，温度22℃，明暗周期12 h∶12 h，在实验室饲养并适应1周。血糖检测前，禁食12～24 h，尾静脉取血备检。以pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制10%STZ，以65 mg·kg-1剂量腹腔注射，注射后每天观察并测量大鼠体质量、食入量、饮水、毛色及活动情况，继续饲养1周，测定尾静脉血糖。血糖检测前大鼠尾静脉取血，血糖计检测，以空腹血糖＞16.7 mmol·L-1作为高血糖状态的判定标准[7]。

1.2.2 创面制备、处理及标本收集 10%水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/100 g）予以麻醉，背部备皮，常规消毒，利用王宝宏发明并制作的动物皮肤创面制备装置（专利证书号：10032087），在大鼠背部脊柱两侧制备4个两两对称的5 mm全层皮肤创面模型[8]。无菌条件下，将二甲双胍研磨至粉末，与医用凡士林1∶2充分混匀，配为霜剂，4℃冰箱保存备用。DM组创面1 cm×1 cm区域涂抹二甲双胍凡士林霜剂，1次/d。于实验第1、3、6、9、12天，每个时间点每组麻醉2只大鼠，快速切取创面组织。收集创面周围1 cm×1 cm区域皮肤全层创面组织，每组8个创面，创面旁放置比例尺并用相机拍照记录，创面组织沿最大直径切开，一半创面置于4%甲醛溶液中固定24 h，垂直放入包埋盒，组织梯度乙醇脱水过夜，浸蜡，石蜡包埋，连续切片10张（厚度4μm），另一半创面组织-80℃冻存。皮肤创面照片利用Photoshop软件进行伤口最大直径测量。

1.2.3 苏木素-伊红染色（HE） 石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水，苏木精液染色室温10 min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化1～3 s，流水冲洗，自来水浸泡返蓝，0.5%伊红液染色30～60 s，梯度乙醇浸泡，80%乙醇1～2 s，95%乙醇1～2 s，无水乙醇1～2 s，二甲苯10 min，中性树胶封片。由Motic数字切片系统扫描保存为数字切片。

1.2.4 免疫组化染色 切片二甲苯脱蜡至水，0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）微波加热修复10 min，冷却，3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗，10%山羊血清室温封闭30 min，吸去，AMPKα1/2的一抗工作液4℃过夜，同时另一切片以PBS取代一抗4℃孵育过夜作为阴性对照；PBS冲洗，生物素化的山羊抗小鼠二抗室温孵育30min，PBS冲洗，试剂盒A（1∶50）和B（1∶50）混合液（A：Avidin溶液；B：生物素化辣根过氧化物酶）室温孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，由Motic数字切片系统扫描保存为数字切片。免疫组化结果判定标准[9]：染色分为阳性和阴性两种结果，以细胞胞膜和（或）胞质出现棕黄色颗粒状着色判断为阳性，以细胞胞膜和（或）胞质内无棕黄色颗粒状着色判断为阴性。AMPKα的阳性着色分布于细胞膜和（或）胞质。

1.2.5 计量组织学分析方法 在每个时间点选取每组大鼠4个不同创面的组织切片，利用采用Motic图像软件测量表皮伤口直径、真皮伤口直径[9]。表皮伤口直径=两侧创缘再上皮化表皮之间区域的长度。AMPKα染色结果的半定量检测[9]：在每个时间点选取每组大鼠4个不同创面的组织切片，镜下区分创旁正常表皮区及RE区，在以上区域分别随机选取5个高倍视野（HPF）。利用Image J软件，将AMPKα染色结果的扫描图片从TIF格式转为8-bit图片，利用软件中Threshold功能选定阳性区域，Threshold参数0.28～2.71，所有待检图片参数保持一致；随后利用Image J软件检测平均OD值（阳性强度，OD值范围：0～2.71）及阳性面积百分数（阳性率，阳性区域占总检测区域的百分比）检测，检测3次，取平均值作为参考值。AMPKα平均阳性强度=AMPKα测量OD值/检测区域总面积。分别检测待测样本每个HPF的AMPKα平均阳性强度，计算多个高倍视野平均阳性强度的均值作为本组样本的测量参考值。AMPKα在RE区KCs细胞中的相对表达水平计算公式：AMPKα相对表达水平=AMPKα在RE区平均阳性强度（OD值）/AMPKα在对应周边正常表皮中的平均阳性强度（OD值）。

1.3 统计学方法

用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，方差不齐时用多个独立样本非参数检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量及血糖

实验前各组大鼠体质量及血糖差异均无统计学意义（P均＞0.05）。实验后（注射STZ 1周后），与NC组大鼠比较，DC组和DM组大鼠出现多饮、多食、多尿及体质量减轻，毛色无光泽，活动度降低；与NC组比较，DC组和DM组大鼠体质量均降低（P均＜0.05）；血糖方面，与NC组比较，DC组和DM组大鼠尾静脉血糖均升高（P均＜0.05）；与DC组比较，DM组体质量和血糖的差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

2.2 创面愈合过程的大体观察

各组大鼠背部急性创面制备成功后，伤口形状规则、圆形，直径5 mm，创面清洁，创缘整齐，仅见极少量出血，无明显渗出。实验第1天，肉眼观察各组大鼠背部创面，伤口均呈较为规则的圆形，创缘周边组织轻度发红、肿胀并略微隆起，创腔内可见少量血痂附着，未见明显脓性渗出及新鲜出血。实验第3天，NC组大鼠伤口收缩减小，创缘整齐；DC组和DM组大鼠伤口肉眼观察亦有收缩变小，与NC组大鼠比较，伤口收缩减小程度较小。实验第6天，NC组大鼠较之前伤口明显收缩减小，甚至个别大鼠伤口已完全愈合；DC组和DM组大鼠伤口肉眼观察亦有收缩变小。实验第9天，NC组大鼠创面均已完成愈合；DC组大鼠较之前伤口轻度收缩变小，尚未完全愈合；DM组大鼠较之前伤口明显收缩变小，呈较规则点状及小圆形，已基本完成愈合。实验第12天，NC组和DM组大鼠伤口均已完全愈合；DC组大鼠伤口明显收缩变小，但尚未完全愈合，见图1。

2.3 创面愈合的镜下特征

实验第1天，由皮肤表层到皮下组织由上到下观察，各组大鼠伤口开放，创底深达浅层皮下组织层（符合模型制备全层皮肤创面的要求）。实验第3天，各组大鼠伤口均显示开放，创缘可见数量不一的再生性KCs细胞构成的RE区，伤口底部可见肉芽组织形成。伴随实验时间变化，各组大鼠镜下伤口长度呈变小的趋势，至实验第12天，仅DC组大鼠部分创面未完全愈合，其他组大鼠均已完全愈合，见图2。镜下表皮伤口长度的测量结果显示，实验第3天，与NC组比较，DC组和DM组伤口均较大（P均＜0.05）；与DC组比较，DM组伤口较大（P＞0.05）。实验第6天，与NC组比较，DC组伤口较大（P＜0.05），DM组差异无统计学意义（P＞0.05）；与DC组比较，DM组伤口较小（P＜0.05）。实验第9天，与NC组和DM组分别比较，DC组伤口较大（P均＜0.05）；NC组及DM组伤口已完成RE区KCs细胞完全覆盖，完成RE过程。实验第12天，与NC组和DM组伤口分别比较，DC组较大（P均＜0.05）；DC组尚未完成RE区KCs细胞覆盖，见表2。

表1 不同处理组大鼠体质量和血糖检测结果比较（±s）

表1 不同处理组大鼠体质量和血糖检测结果比较（±s）

与NC组比较*P＜0.05。

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图1 各组大鼠创面愈合过程大体图

2.4 AMPKα的表达

2.4.1 AMPKα在各组大鼠皮肤组织中的表达 AMPKα主要表达在表皮、毛囊、皮脂腺及浅层横纹肌组织中，其中在表皮角质形成细胞中的表达最多。AMPKα在大鼠皮肤表皮各层细胞中表达不同，基底细胞显示低表达，棘层细胞低到中等强度表达，颗粒层及角化层细胞高表达。为定位于胞质和胞膜的棕黄色染色。AMPKα在大鼠正常表皮中的表达，NC组OD值为（0.51±0.08）（n=40 HPF），DC组OD值为（0.53±0.08）（n=60 HPF），DM组OD值为（0.54±0.07）（n=60 HPF），与NC组比较，DC组和DM组表达差异均无统计学意义（P均＞0.05），见图3。

图2 各组大鼠创面组织HE染色（箭头：镜下表皮创缘）

表2 各组大鼠镜下表皮伤口长度比较（±s，mm）

表2 各组大鼠镜下表皮伤口长度比较（±s，mm）

与同时间DC组比较*P＜0.05。

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图3 AMPKα的免疫组化染色（黑箭头为创缘）

2.4.2 AMPKα在各组大鼠创面RE区KCs细胞中的表达 AMPKα在NC组、DC组及DM组大鼠创面RE区KCs细胞中呈淡黄色或黄色低强度表达（图3D～I）。第6天和第12天，不同处理组大鼠RE区AMPKα表达OD值测量结果显示：NC组、DC组和DM组RE区均低于其对应周边表皮组织（P均＜0.05），见表3。

表3 不同处理组大鼠皮肤创面AMPKα表达的OD值测量结果比较（±s）

表3 不同处理组大鼠皮肤创面AMPKα表达的OD值测量结果比较（±s）

与对应周边表皮比较*P＜0.05。

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2.4.3 AMPKα在各组大鼠创面RE区KCs细胞相对表达水平的比较 比较不同处理组大鼠RE区AMPKα的相对表达水平：第6天和第12天，NC组、DC组及DM组的三组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）；NC组与DC组间差异无统计学意义（P均＞0.05）；与NC组比较，DM组均较低（P均＜0.05）；与DC组比较，DM组较低（P均＜0.05），见图4。

图4 AMPKα在再上皮化角质形成细胞相对表达水平比较

3 讨论

研究发现，糖尿病创面难愈可能与创面高糖微环境，糖基化终末产物（AGEs）增多以及活性氧（ROS）过度激活的损伤有关[10]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种在进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛参与对蛋白质、脂肪、糖和核苷酸代谢的调节[5]。AMPK是一个异三聚体结构，包含1个催化亚基α（α1和α2）及两个调节亚基β（β1和β2）及γ（γ1，γ2和γ3），β亚基连接α及γ亚基，γ亚基具有AMP和ATP的理论结合位点[5]。研究发现[11]AMPK能够直接感知葡萄糖，通过溶酶体途径磷酸化激活AMPK。目前AMPK在创面愈合过程中RE区的表达模式还不清楚。本研究通过建立高血糖大鼠急性皮肤创面模型，为AMPK参与调控创面修复的机制研究提供实验证据。

本研究的实验结果显示，DC组和DM组大鼠血糖均高于16.7 mmol·L-1，体质量低于NC组大鼠，与文献报道一致[12]。在创面愈合过程动态观察中发现，实验第6天NC组大鼠愈合明显，未愈合区伤口规则，创面清洁；DC组大鼠虽有收缩变小，但创面缺损区面积较NC组大，伤口形状欠规则，提示高血糖大鼠创面愈合不良，发生DWH。本实验的镜下表皮伤口长度测量结果也显示，实验第3、第6、第9和第12天，DC组大鼠均大于NC组；实验第12天NC组大鼠伤口RE区已被再生表皮完全覆盖，完成RE过程，但DC组大鼠仍有部分区域未完全愈合，RE区未完全被再生表皮覆盖。以上结果证实高血糖大鼠创面出现DWH，并出现RED情况与文献报道基本一致[8]，提示本研究的高血糖大鼠创面延迟愈合（DWH）模型制备成功。皮肤创面RE区的KCs细胞属于上皮细胞，在创面修复过程中，再生的上皮细胞可以转变为具有增殖和移行能力的间质样细胞，其成熟上皮的标记物（K10和CFTR等）或细胞间连接蛋白（E-cadherin及Zo-1等）出现下调表达[9]。本实验发现，在NC组、DC组及DM组大鼠中，伴随创面愈合过程，RE区AMPKα均出现下调表达低于周围正常皮肤表皮，这与文献报道[9]的成熟上皮标记物及细胞间连接蛋白表达模式非常类似，提示AMPK可能是KCs细胞成熟分化的潜在标记物，其下调表达可能参与了对其增殖和移行的促进作用。本实验的结果还显示，DC组大鼠皮肤表皮AMPK本底表达水平较正常血糖组高，提示高糖可能会诱导AMPK表达升高并参与对RE过程影响和调节。有研究[13]发现，AMPK激活剂可以抑制体外培养的KCs细胞生长，提示AMPK介导的能量代谢途径对KCs细胞有潜在影响。AMPK还可以被其上游钙相关的激酶LKB1磷酸化激活，磷酸化激活的AMPK可以部分介导上皮细胞紧密连接的组装和分解[14-15]。以上研究提示AMPK上调表达与上皮细胞的成熟分化正相关，成熟分化的上皮细胞会出现增殖和移行能力的降低。在创面愈合过程中，RE区KCs细胞E-cadherin可出现先下调表达情况[16]，这一点与AMPK的表达模式也非常相似。因此，AMPK在RE区的下调表达可能有利于KCs细胞增殖和移行，促进RE过程早期和中期快速覆盖创面的过程；一旦RE过程完成，AMPK在再生的表皮中可能会逐步上调表达，逐渐完成对表皮结构和功能的重建和恢复，当然这还属于科学假设，需要未来的工作进一步研究证实。

降糖药二甲双胍外用可以促进糖尿病大鼠创面愈合过程[6，8，17]，同时二甲双胍是AMPK的激活剂已被证实[5]；但二甲双胍是否是通过影响AMPK表达参与创面修复的调节，目前还不清楚。本实验中，我们利用二甲双胍霜剂局部处理高血糖大鼠（DM组）创面，结果显示，在DM组大鼠创面愈合明显好于DC组大鼠，并接近NC组的愈合情况。在本实验的第6、第9和第12天，DM组大鼠表皮伤口长度小于高血糖组；实验第12天DM组大鼠伤口RE区已被再生KCs细胞完全覆盖，完成RE过程。提示二甲双胍促进了高血糖大鼠创面愈合过程，改善了其DWH和RED问题，可能对RE过程具有一定的调节作用。本实验进一步观察了二甲双胍处理的高血糖大鼠创面RE区AMPK的表达情况，发现第6天及第12天，DM组大鼠RE区AMPK表达均低于NC组和DC组，提示AMPK的相对低表达对于创面愈合的RE过程具有潜在促进作用，二甲双胍促进糖尿病创面愈合可能与改善RED有关。研究表明AMPK可能不单通过其磷酸化调节细胞功能[5]，其本身的表达也会对细胞功能产生影响，当然具体机制阐明也一定需要结合未来对AMPK磷酸化情况研究进一步证实。有研究发现AMPK可以抑制转化生长因子、血管紧张素及醛固酮诱导的上皮间质转化（EMT）过程，同时促进间质上皮转化（MET）[18]。还有研究发现AMPK可以被其上游钙相关的激酶LKB1磷酸化激活，磷酸化激活的AMPK可以部分介导上皮细胞紧密连接的组装和分解[14，19]，提示AMPK参与对EMT/MET的复杂调节作用，这样的情况在气道[20]和消化道上皮[15]上也被验证。以上研究与本项目关注的皮肤表皮KCs细胞的实验结果相似，提示AMPK对上皮细胞功能状态的调控作用可能具有相对的广泛性。高糖可引起皮肤KCs细胞AMPK表达升高，但AMPK激活剂却可以下调其表达，其中具体作用机制仍不清楚，需进一步研究。