TRPC6与OMP在慢性鼻-鼻窦炎患者嗅上皮中的表达及与嗅觉功能相关性分析

曹磊，王竹，李巍，李培华

(1. 徐州医科大学研究生学院，江苏 徐州 221004； 2. 徐州医科大学附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，江苏 徐州 221006)

嗅觉是鼻的生理功能之一，它不仅使人们辨别香、臭等气味，并与食欲、味觉、身心健康和情感息息相关。嗅觉具有报警作用，对人们的生活质量影响很大[1]。引起嗅觉障碍的病因很多，主要有鼻窦疾病、上呼吸道感染及外伤等，其中慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis, CRS)是引起嗅觉障碍最常见的病因，约一半以上的患者有CRS的病史[2]。CRS引起的嗅觉减退被归类为传导性嗅觉减退，CRS患者的嗅觉缺陷传统上归因于鼻塞，即黏膜水肿和嗅裂的气流减少[3]。然而通过功能性鼻内镜手术，解除患者的梗阻后，患者的嗅觉改善往往难以预测，少部分患者嗅觉功能得到改善，但大部分患者嗅觉改善不理想[4]。哺乳动物的嗅神经元(olfactory neurons,ORNs)具有不断再生分化的能力[5]。CRS导致嗅觉的减退机制，可能跟嗅感觉细胞的生成与凋亡稳态失调有关[6]。而瞬时受体电位通道6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)作为细胞内的重要第二信使Ca2+的主要通道之一，其在神经细胞生长分化、增殖及凋亡中扮演着重要角色[7]。本研究通过检测TRPC6和嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein，OMP)在CRS伴嗅觉障碍患者嗅觉黏膜中的表达情况，初步探讨TRPC6与CRS导致的嗅觉障碍的关系，希望为CRS导致的嗅觉减退提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 标本采集及分组

选取2018年12月—2019年9月在徐州医科大学附属医院就诊的CRS伴有重度嗅觉障碍(均经过T&T嗅觉检测)的20例患者作为实验组，其中男14例，女6例；平均年龄(32.00±4.08)岁；同期选取10例鼻中隔矫正患者作为对照组，其中男6例，女4例，平均年龄(31.70±3.39)岁，均无嗅觉障碍；实验组和对照组在年龄和性别方面均无统计学差异(P>0.05)，两组具有可比性。纳入标准：18～40岁的年轻患者，排除因年龄导致的嗅上皮退化。患者继往无鼻部手术史，无头部及鼻部外伤史，无癫痫、中风等重大脑部疾病史，无头颈部放疗史，无有害化学物吸入史，无上呼吸道感染引起的嗅觉减退病史。通过CT检查，鼻内镜检查，排除梗阻引起的嗅觉减退、嗅区息肉样变及泡状鼻甲等。在手术中钳取患者中鼻甲上极鼻中隔面嗅区黏膜作为标本，制作切片。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理道德委员会批准执行，所有患者均签署相关实验知情同意书。

1.2 T&T嗅觉定量检查法

选择苯乙醇(花香-玫瑰花香味)、甲基环戊烯酮 (焦糊-甜焦糊味)、异戊酸 (汗臭-臭袜子味)、十一烷酸内酯(果香-熟桃子味)和三甲基吲哚(臭-粪臭味)5种嗅物。以每10倍间隔对嗅物进行稀释。共稀释8个阶段。用5、4、3、2、1、0、-1、-2表示。0为正常嗅觉的阈值浓度。5为浓度最高，依次减弱，-2最低。试验时，取宽为0.7 cm，长为15 cm的无味滤纸，浸沾试嗅剂，令受试者闻嗅，每种嗅物用一纸滤条，每次均定浸沾1 cm。把结果记录在以嗅物名称为横坐标，嗅物浓度为纵坐标的嗅表上,用曲线反映嗅阈水平。将5种嗅物的识别阈记分相加，求其平均值。嗅觉障碍程度等于5种嗅物的识别阈之和除以5。当5的试纸条仍不能识别时，得分为6。小于1分为正常，1～2分为轻中度嗅觉障碍，2～5分为重度嗅觉障碍，大于5分记为嗅觉丧失[8]。

1.3 实验试剂

兔TRPC6多克隆抗体购于Sigma公司；兔OMP多克隆抗体购于LSBio公司；β-actin单克隆一抗购于美国USB公司；羊血清、兔二步法试剂盒、DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复液、30%过氧化氢购自北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗稀释液、二抗稀释液、显影定影试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；58～60℃熔点石蜡、60～62℃熔点石蜡购于上海标本模型厂。

1.4 OMP和TRPC6免疫组化检测

样本用使用4%多聚甲醛固定24 h后，进行脱水、浸蜡、包埋，用轮转式石蜡切片机切片，厚度为4 μm。采用链菌素亲生物素-过氧化物酶免疫组织化学法检测，操作如下：石蜡切片脱蜡后，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，0.4%胃蛋白酶消化6 min，PBS冲洗3次，再置于0.01M枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中进行微波加热20 min。取出后冷却至室温，滴加3% H2O2，室温10 min，再滴加马血清，室温30 min，滴加一抗(羊抗OMP多克隆抗体或兔抗TRPC6多克隆抗体)，4℃过夜，PBS冲洗3次，滴加二抗(生物素化免抗山羊IgG)工作液(稀释比为1∶200)，室温1 h，PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉亲和素，室温1 h，PBS冲洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，室温30 min，PBS冲洗3次，苏木素复染，水洗，盐酸乙醇分化，常规脱水、透明、封片，置于光学显微镜观察。

1.5 蛋白印迹分析(Western Blot)

将术中收集的嗅上皮组织进行蛋白裂解，提取总蛋白。随后将变性的蛋白使用10%～12% SDS-PAGE进行电泳。电泳完成后将蛋白转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，加入吐温20的Tris-盐酸缓冲液(TBST)冲洗3次。将PVDF膜浸泡在相应的一抗中，4℃摇床过夜，TBST冲洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗(稀释比为1∶1 000)，室温孵育2 h。采用ECL化学发光法进行显色。使用Image J软件进行灰度值分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者嗅觉功能评估结果

实验组T&T嗅觉评分为(3.79±0.90)分，而对照组T&T嗅觉评分为(0.36±0.31)分，差异具有统计学意义(t=11.59,P=0.000 1)。

2.2 两组患者嗅上皮组织OMP和TRPC6免疫组化结果

OMP的免疫反应物为棕褐色，主要存在于嗅上皮的包膜及胞浆中。OMP免疫组化结果表明，与对照组相比，实验组OMP的表达水平显著低于对照组。TRPC6的免疫反应物为棕褐色，主要表达于嗅上皮的包膜及胞浆中。与对照组相比，实验组TRPC6的表达显著低于对照组。可以看到TRPC6在嗅感觉神经元及球基细胞中表达。见图1。

2.3 两组患者嗅上皮组织OMP和TRPC6 的Western Blot结果

如表1和图2所示，Western Blot结果表明，与对照组相比，实验组OMP和TRPC6蛋白表达水平显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 嗅上皮组织OMP和TRPC6表达水平与T&T嗅觉评分相关性分析

为了探讨嗅上皮组织中OMP和TRPC6表达水平是否与嗅觉损伤程度有关，采用Western Blot检测嗅上皮组织中OMP和TRPC6的表达量。因OMP及TRPC6灰度比值不符合正态分布，故采用Spearman秩相关分析。与对照组相比，实验组OMP和TRPC6蛋白表达水平显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，嗅觉功能减退越严重，嗅上皮组织中OMP和TRPC6表达量越低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与此同时，对嗅上皮组织中OMP和TRPC6表达量与T&T嗅觉评分进行相关性分析，结果表明其T&T评估得分与嗅上皮组织中OMP和TRPC6表达水平呈现负相关(OMP：R2=0.853 8,P<0.001;TRPC6：R2=0.91,P<0.001)。见图3。

3 讨论

TRPC6被发现广泛表达于神经元细胞中，如视网膜神经节细胞、心脏神经元、嗅上皮和部分大脑细胞中，如皮质、黑质、海马和小脑细胞[9]。TRPC6存在于小鼠嗅觉上皮细胞中，但是TRPC6在嗅觉系统机制中的作用却仍不清楚。本研究中我们在CRS伴嗅觉减退患者的嗅黏膜中检测到了TRPC6的表达，免疫组化着色于ORNs、嗅鞘细胞膜及胞浆内。OMP于1972年被发现，是嗅觉通路中唯一可被标记的脑蛋白，其主要表达于嗅细胞和微绒毛细胞，OMP跟嗅觉功能具有高度相关性，CRS患者嗅觉黏膜中OMP的表达降低[10]，跟本研究结果一致。T&T检测评分与OMP的蛋白电泳的相关性分析得出，CRS患者嗅上皮的OMP降低与嗅觉评分具有高度的相关性，这跟既往的研究相符。通过TRPC6的蛋白电泳与T&T评分的相关性分析，我们得出T&T检测评分与TRPC6也具有高度的相关性，而这两者都成负相关。可以推断出，CRS患者嗅上皮中TRPC6的降低，跟患者的嗅觉功能减退有关，即TRPC6表达越少，嗅觉功能减退越明显。

图1 嗅上皮组织OMP和TRPC6免疫组织化学染色结果，箭头所示为阳性染色细胞 A：对照组OMP染色结果；B：实验组OMP染色结果；C：对照组TRPC6染色结果；D：实验组TRPC6染色结果 (A、B：免疫组化 ×400；C、D：免疫组化 ×200)

表1 各组嗅黏膜OMP、TRPC6与β-actin灰度比值

图2 嗅上皮组织中OMP和TRPC6的Western blot结果 A：OMP和TRPC6的蛋白条带，1和4为实验组，2和3为对照组；B：两组组织样本OMP和TRPC6柱状图结果(与对照组相比，***P<0.001)

图3 不同程度嗅觉功能减退与OMP和TRPC6表达的关系以及与嗅觉评估得分的相关性 A、B：实验组不同程度嗅觉障碍患者OMP表达与对照组比较及与对应的T&T嗅觉评估得分的相关性分析；C、D：实验组不同程度嗅觉障碍患者TRPC6表达与对照组比较及与对应的T&T嗅觉评估得分的相关性分析

嗅觉障碍是CRS的常见伴随主诉之一，嗅觉的减退严重地影响了患者的生活质量[11]。经过正规功能性鼻内镜手术治疗和药物治疗(主要是局部和全身激素的使用)，很大一部分患者的嗅觉恢复不佳或恢复不全[12]。故除去CRS引起的鼻腔阻塞等物理因素外，人们开始从根本上研究嗅觉减退的原因，而ORNs为嗅上皮的嗅感觉单位，其增殖成熟及凋亡，被认为是嗅觉减退的主要因素之一。ORNs具有终生自我更新的能力，ORNs的生存周期为1个月左右[13]。ORNs在受损后，发生凋亡，后新生的ORNs替代凋亡的细胞，细胞持续更替以维持嗅觉的发生，而嗅感细胞的增殖、分化、成熟和凋亡失调，即ORNs细胞凋亡速度超过了细胞增殖成熟的速度，则会引起嗅觉减退[14]。我们的实验表明，实验组TRPC6的表达明显降低，OMP表达同样降低，并且TRPC6与OMP的表达都与T&T嗅觉测定评分呈高度相关性，而OMP只有在成熟的ORNs中表达，故我们推测TRPC6可能通过影响ORNs的分化、成熟、凋亡，进而影响嗅觉功能。其机制可能如下：TRPC6参与神经元生长的锥导向，已知脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可促进神经元存活和分化，并在体外和体内指导轴突延伸。BDNF诱导的轴突生长锥的化学引诱需要Ca2+信号传导。Li等[15]发现在培养的小脑颗粒细胞中，TRPC通道有助于BDNF诱导的生长锥Ca2+升高，并且是BDNF诱导的化学引诱性转向所必需的。而通过干扰RNA表达，下调了TRPC3和TRPC6的表达后，消除了BDNF诱导的Ca2+升高和生长锥转向。因此，TRPC6通道活性对于BDNF引导神经生长锥至关重要。在刺激因素下，轴突转向因子BDNF表达发生改变，激动轴突生长锥上的特异性受体，从而使轴突不停地延伸或缩短，从而使着轴突向着靶点生长。ORNs的前体细胞为球基细胞，在ORNs的轴突或嗅球受到损伤后，球基细胞进行有丝分裂，形成基部的轴突和顶部的树突，轴突向嗅球延伸，最终和嗅球形成新的突触，然后形成成熟的ORNs[16]。嗅鞘细胞(olfactory ensheating cells，OECs)是包绕在嗅神经轴突外的特殊胶质细胞，OECs具有促进神经元轴突再生的功能，而这一功能是通过OECs分泌的促进轴突生长的因子进行的[17]。这些因子包括：BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)[18]。BDNF同样促进ORNs的轴突生长。只有成熟的ORNs才具有表达OMP的能力，而OMP则是嗅觉形成的基础蛋白。TRPC6作为BDNF的下游通道蛋白，通过影响Ca2+内流，改变其对轴突的锥导向作用，从而影响ORNs的成熟，进一步影响OMP的表达，从而引起嗅觉的改变[19]。

TRPC6有利于小脑颗粒细胞的存活，Jia等[20]发现小脑颗粒细胞培养物中，阻断TRPC通道或下调TRPC3或6抑制BDNF介导的保护，BDNF触发的细胞内Ca2+升高和BDNF诱导的cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)激活。相比之下，过表达TRPC3或6可以增加CREB依赖的应答基因的转录，并防止缺乏血清的神经元发生凋亡，并且这种保护作用被CREB阻断。此外，下调TRPC3或6诱导新生大鼠小脑中的小脑颗粒细胞凋亡，并且通过提高表达TRPC3或6来挽救这种作用。因此，体内和体外的证据都表明TRPC6通道对促进神经元存活很重要。在嗅上皮中，有研究表明，嗅球可以分泌营养因子，BDNF、NGF和GDNF等，通过轴浆运输逆行至ORNs胞体，用来维系ORNs的存活[21]。TRPC6作为BDNF的下游通道蛋白，可以保护神经元细胞，TRPC6的表达下调可能导致嗅感细胞的大量凋亡，从而引起嗅觉减退。

TRPC6参与树突的生长和树突棘形成：之前的研究发现TRPC家族成员TRPC6可以促进海马神经元树突生长。研究发现TRPC6在大鼠海马中的表达高峰在出生后7～14 d，这一时期被认为是树突状细胞最大生长的重要时期[22]。TRPC6的过表达增加了海马培养中钙调蛋白依赖性激酶IV(calmodulin-dependent protein kinase-IV, CaMK-Ⅳ)和CREB的磷酸化，促进了树突的生长。下调TRPC6可抑制CaMK-IV和CREB的磷酸化，并损害树突状细胞的生长。抑制Ca2+内流，抑制了TRPC6对树突状细胞生长的影响。而在TRPC6转基因小鼠中，CaMK-IV和CREB的磷酸化增强，树突状细胞的生长也增加。综上所述，TRPC6通过CaMK-IV/CREB途径促进树突状细胞生长。此研究揭示了TRPC6在CNS发育过程中的新作用。树突正常的生长发育和树突棘的形成是神经元之间建立突触联系、传递信号及神经网络建立中重要的环节。而树突发育异常则会影响智力发育或导致疾病的发生，如阿尔兹海默病、唐氏综合征和X染色体易裂症等[23-25]。作为双极神经元，ORNs的树突是其感受气味分子刺激的部分，然后将兴奋传入嗅球，在至大脑皮层中的嗅觉皮质，TRPC6减少后，引起树突生长障碍，进而导致嗅觉障碍。

综上所述，TRPC6的稳定表达在神经元的存活、树突的生长发育及神经网络的建立过程中都发挥着重要的作用，这些作用关系着神经元的生成、成熟和凋亡。CRS患者嗅上皮长期处于慢性炎症环境中，可能会引起嗅上皮细胞的TRPC6表达下调，从而影响ORNs增殖成熟障碍，导致OMP表达下调，从而引起嗅觉减退。本研究TRPC6在CRS引起的嗅觉减退患者的嗅上皮中表达下调，OMP同样表达下调，且T&T得分与TRPC6与OMP表达都呈负相关，故我们推断TRPC6的表达下调可能是导致CRS引起嗅觉减退的生物学机制之一。