通关藤提取物对HepG2肝癌细胞增殖抑制的影响*

黄争荣 林锦培 王 泳 赖义勤 张劭琴 何火聪

原发性肝癌(简称肝癌)是临床上常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率居恶性肿瘤的第4位，肿瘤相关死亡第2位[1]。目前原发性肝癌的治疗手段有手术、介入、靶向等，但由于肝癌起病隐匿，恶性程度高，病程短，临床上较难早期发现，确诊时往往病情已进入晚期，无法进行根治性治疗，而中医药在肝癌综合治疗中具有日益重要的地位。既往研究[2，3]发现，通关藤对肝癌具有良好的抗肿瘤疗效，能够改善患者生活质量。因此，本研究就该药物的抗肿瘤作用作进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂MTE购于南京圣和药业有限公司(商品名：消癌平注射液，国药准字Z20025868，生药浓度为2.5 g/ml)；胎牛血、胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培养基(Hyclone公司，美国)；二甲亚砜(DMSO)(Gibco公司，美国)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(索莱宝科技有限公司，北京)；碘化丙锭、细胞周期试剂盒(Becton Dickinson公司，美国)。

1.2 主要仪器流式细胞仪(Becton Dickinson公司,美国)；IX70倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；冷冻离心机(Thermo Electron 公司，美国)；超净工作台(苏州净化设备公司，江苏)；CO2培养箱(Thermo Electron公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养人肝癌细胞HepG2系由福建省肿瘤医院生物放射研究室传代培养。将HepG2肝癌细胞复苏后，悬浮生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。取状态良好、处于对数生长期HepG2细胞进行实验。

1.3.2 MTT法检测MTE对HepG2细胞增殖的作用将HepG2细胞以密度为2×104个细胞/孔接种于96孔培养板，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁，分别加入不同浓度的MTE (7.5 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、60 mg/ml)，同时设空白对照组和调零组，每组3个复孔，置CO2培养箱中继续培养12 h、24 h、48h。实验终止前4 h各加入MTT溶液10μl/孔，再置培养箱中培养4 h后，吸去培养孔内培养液。每孔加入100 μl DMSO，放置摇床低速振荡10 min，待产生的蓝紫色结晶溶解后，用酶标仪检测各孔OD值(490 nm)。计算抑制率：抑制率=(1-药物处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.3 克隆形成实验观察MTE对HepG2肝癌细胞增殖的作用取对数生长期HepG2细胞，用0.25%胰酶消化并用吸管吹打成单个细胞，分别接种于含完全培养液的6孔板中，200个细胞/孔。轻轻摇动，使细胞分散均匀，24 h细胞贴壁后吸弃培养基，设置实验组和空白对照组，实验组各孔分别加浓度为15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE含药培养基，每孔2 ml，对照组加等体积培养基。置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养48 h后，吸取培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，用纯甲醇固定细胞，加适量姬姆萨色素染细胞核10 min，然后用清水缓慢洗去染色液，干燥。将6孔板底部贴一张带网格的透明胶片，倒置显微镜下计数克隆，含50个细胞以上形成的细胞集落为1个克隆，并计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.3.4 流式细胞术检测MTE对HepG2肝癌细胞细胞周期的影响将细胞浓度为5×104/ml HepG2细胞接种于25 ml培养瓶，常规培养24 h后，加入终浓度为15 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml MTE，设空白对照组。作用24 h后取出细胞，用将0.25%胰蛋白酶消化，收集1×106/ml细胞，用0.01 mol/L PBS pH 7.2清洗，离心(1500 rpm，5 min)，共2次。用300 μl PBS重悬，然后加入700 μl预冷的无水乙醇，固定30 min后，用PBS洗涤细胞2次。每管加入200 μl碘化丙锭(含100 μg/ml RNase)染色30 min，上流式细胞仪分析、检测。

1.3.5 统计学方法实验每组细胞平行重复3次。实验数据应用SPSS 24.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTE对HepG2肝癌细胞增殖的影响经不同浓度药物作用24 h，各剂量组MTE对HepG2肝癌细胞增殖均表现明显抑制作用，抑制率随药物浓度的增加而增加，呈剂量与时间依赖效应关系。5个不同浓度MTE组对HepG2肝癌细胞抑制作用均随时间延长而增强，呈时间依赖效应关系。见图1。

图1 MTE对HepG2肝癌细胞增殖的影响

2.2 MTE对HepG2肝癌细胞克隆形成的影响HepG2肝癌细胞经不同浓度MTE作用后，细胞克隆能力明显下降，克隆形成数目显著低于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而且形成的细胞克隆直径也小于空白对照组。见图2、表1。

注：A: 0 mg/ml组, B:15 mg/ml组, C:20 mg/ml组, D:30 mg/ml组

表1 MTE对HepG2肝癌细胞克隆形成的影响

2.3 MTE对HepG2肝癌细胞周期的影响流式细胞术检测发现，随着MTE作用浓度的增加，G1期细胞所占的比例逐渐上升，S期细胞所占的比例逐渐下降，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表2。

图3 MTE对HepG2肝癌细胞周期的影响

表2 MTE对HepG2肝癌细胞周期的影响

3 讨论

通关藤为萝藦科牛奶菜属植物，最早载于《滇南本草》，主要分布于云南、贵州、广西等亚热带地区，味苦、微甘，性凉，具有清热解毒、止咳平喘、祛痰等功效[4]。近年来，对通关藤的抗肿瘤作用研究已引起广泛的关注，越来越多研究表明通关藤具有较强的抗肿瘤生物活性[5-7]。

本研究发现，经MTE作用后HepG2肝癌细胞生长速度明显减慢，各浓度的MTE对HepG2肝癌细胞均有明显的抑制作用，抑制率与对照组相比差异均有显著性，且随着MTE浓度增加和培养时间的延长，抑制作用增强，且呈明显的量效关系和时效关系。另外，通过细胞克隆源性分析法验证MTE对体外培养的HepG2肝癌细胞克隆形成的抑制效果，各实验组细胞克隆形成率均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。上述两种实验表明MTE对HepG2肝癌细胞增殖具有明显抑制作用。

细胞增殖是细胞生命活动的基本特征之一。细胞通过细胞周期实现增殖，细胞周期调节失控是肿瘤发生、发展的重要原因。细胞周期中某些重要的信号分子和周期蛋白家族发生突变或表达水平发生改变，导致细胞周期调控改变，促使细胞增殖不受控制，分化能力减弱，丧失原有的细胞功能，最终发展成肿瘤细胞[8]。肿瘤细胞增殖的速度主要取决于细胞G0/G1期的长短，G0/G1期短，进入S期细胞增多，则肿瘤细胞增殖快，所以G1/S过渡是细胞周期进程的关键[9]。本实验结果显示，不同浓度的MTE作用于HepG2肝癌细胞24 h后，肝癌细胞周期发生明显变化，G0/G1期细胞百分比上升，S期和G2期细胞百分比下降，提示MTE能够诱导HepG2肝癌细胞G1/S期阻滞，表现为细胞周期停滞在G0/G1期，不能进入S期而使细胞生长周期延长，细胞的恶性增殖减慢。由此提示，MTE对HepG2肝癌细胞具有一定的抑制作用，其机制可能是阻断细胞周期，从而发挥抗肿瘤作用，但如何影响细胞周期G1/S检查点调控信号机制仍需进一步研究。