番茄SlUDP基因的克隆及其在镉、干旱和盐胁迫中的响应分析

耿鑫鑫，于丽杰，陈 超，金晓霞

(哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，“植物生物学”黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150025)

近年来，我国受到镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)等重金属污染面积较广。Cd是一种剧毒重金属，是生物非必要元素之一，被国际癌症研究中心(IARC)等国际组织列为环境风险首要控制元素之一[1]。Cd作为土壤重金属主要污染控制元素之一，具有较强的毒性，植物根系最先受到重金属毒害而表现为根系生长缓慢、根系发黑等[2-4]；同时，干旱、盐碱和高温等其他非生物胁迫因素也严重影响植物的生长发育，引起一系列生理生化变化，严重时容易导致植物的整株死亡，这对农业生产产生了极大影响[5]。干旱是影响植物性状的显著影响因子之一，干旱胁迫对叶相对含水量、叶绿素含量等性状都会产生显著影响[6-8]；盐胁迫能够破坏土壤结构，使植物烂根、萎蔫、生长受阻等[9-10]。

糖基转移酶不仅是多糖合成的关键酶，同时也是催化糖基反应的酶，在非生物胁迫下能够起到重要的作用，通过一系列蛋白修饰参与到植物抵抗非生物胁迫反应中[11-12]，这些非生物胁迫主要包括干旱、盐、高温等。例如，拟南芥UGT75X能够在干旱、盐胁迫下上调表达[13]，拟南芥UGT-LIKE基因在375 mmol/L甘露醇和150 mmol/L NaCl处理下该基因的表达量也明显升高[14]，玉米次生代谢糖基转移酶UFGT2通过黄酮醇修饰能够提高植物对非生物胁迫的耐受性[15]。一直以来，对糖基转移酶的研究主要以拟南芥为材料，揭示出它们在植物生命周期中扮演不同的角色[16-17]。

本试验前期通过高通量测序分析筛选获得一个UDP-糖基转移酶基因，番茄镉胁迫下该基因的表达量显著升高，即其参与番茄镉胁迫应答反应，但还需进一步对该基因如何参与番茄镉或其他非生物胁迫反应进行深入研究。UDP-糖基转移酶与植物关系较为亲密[18]，能催化多种底物并通过糖基转移酶的糖基化作用来参与植物对非生物胁迫的适应[19-20]。拟南芥UGT85A5基因属于UDPGT超基因家族，在烟草中的外源表达显著提高了烟草对盐胁迫的适应能力[21]；花生中克隆AhUGT83A1-like的UDP-葡萄糖基转移酶的基因显示了参与花生对干旱、低温和高盐抗性的调控[22]；目前，有关UDP-糖基转移酶的研究主要集中在拟南芥、大豆等植物对干旱、盐胁迫下的表达[23-25]，但是研究番茄在非生物胁迫下的表达，特别是对于重金属胁迫的研究较少，而番茄作为世界重要的园艺作物之一，研究其抗逆机理尤为重要。

本试验以番茄(Lycopersicon esculentumMill.)为试验材料，通过克隆得到UDP-糖基转移酶基因，命名为SlUDP基因，利用生物信息学对其氨基酸序列及系统进化树等进行预测，并通过荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达特性以及在镉胁迫下番茄根和叶的表达量变化，进一步利用酵母表达系统对SlUDP基因进行转基因酵母功能验证，探究该基因在3种不同非生物胁迫条件下(镉、干旱和盐胁迫)的表达特征，为糖基转移酶基因SlUDP的后续研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用的植物材料为番茄常规商品种红罗成，根据植物分子生物学实验室前期的材料筛选，为镉敏感型番茄品种。提取四叶期的番茄根和叶的总RNA，合成番茄总cDNA，用于克隆待用。用50 μmol/L CdCl2对四叶期的番茄苗进行处理，分别在处理后0，1，2，3，4与5 d，剪取根部和叶片各0.1 g，放入-80 ℃冰箱保存，用于表达分析。

菌株材料由上海唯地生物和中宜生物公司提供的酵母感受态INVSC1和大肠杆菌DH5α感受态细胞。

1.2 试验方法

1.2.1SlUDP基因的克隆SlUDP通过NCBI中Blast在线查找，GenBank登录号为XM-004249181.3，通过Primer 5.0软件设计SlUDP基因的特异性引物(表1)。试验首先提取番茄叶片总RNA(RNA提取试剂盒由康为世纪公司提供)。反转录合成番茄cDNA。以其为模板，通过PCR扩增得到SlUDP基因cDNA序列，PCR反应体系为9.5 μL ddH2O、1 μLSlUDP-R (10 μmol/L)、1 μLSlUDP-F (10 μmol/L)、12.5 μL 10×PCR Buffer Mix、1 μL cDNA，共25 μL。PCR反应程序：94 ℃ 8 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，用OMEGA Gel Extraction kit凝胶回收试剂盒(OMEGA公司)进行PCR产物纯化。纯化产物克隆入pGM-T (天根公司)，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，采用质粒小提试剂盒(康为世纪公司)提取质粒，经双酶切进一步验证后，送上海生工公司测序。

表1 PCR特异性引物序列Tab.1 PCR specific primer sequences

1.2.2SlUDP基因生物信息学分析 根据SlUDP的基因序列，通过NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站进行在线比对；使用ClustalW多重比对软件对氨基酸序列的同源关系进行分析，以及在Neighbor-joining的基础上构建系统进化树；通过Psipred软件对氨基酸二级结构进行预测；通过ORF Finder 分析预测开放阅读框。

1.2.3SlUDP基因的组织表达特性分析 取生长90 d的同一植株番茄叶、根、主茎、侧茎、花、果实各0.1 g(各组织部位设置3次生物学重复)，放入液氮速冻，提取RNA，反转录为cDNA，内参为β-Actin，采用荧光定量PCR进行定量分析，对数据进行统计分析。

1.2.4 镉胁迫下SlUDP基因的表达处理 对3-4叶期番茄幼苗的根和叶用CdCl2(50 μmol/L)处理。每个时间点3次生物学重复，材料放入液氮速冻后于-80 ℃保存待用。提取根和叶的RNA，反转录为cDNA。用Primer 5.0设计所需引物，番茄的内参基因为β-Actin。使用荧光定量PCR进行定量分析，对数据进行统计分析。

1.2.5SlUDP基因酵母过表达载体的构建 将pGM-T-SlUDP质粒经XbaⅠ、KpnⅠ双酶切后，回收片段；酵母表达载体pYES2以XbaⅠ、KpnⅠ切开，将回收的片段与之连接，构建重组质粒pYES2-SlUDP，重组质粒及pYES2空载体分别转化酵母INVSC1感受态中，筛选出阳性克隆送样测序。酶切、连接、转化、筛选和鉴定等步骤均按常规分子克隆方法进行。

1.2.6 转SlUDP基因酵母非生物胁迫处理 从酵母pYES2-SlUDP和pYES2转化子中分别挑取单个克隆于SC-U液体培养基(2%葡萄糖)中培养。30 ℃培养16～20 h，5 000 r/min离心1 min，弃上清；5 mL SC-U诱导培养(2%半乳糖)重悬菌体，30 ℃诱导表达24 h，5 000 r/min离心1 min，0.9%NaCl重悬菌体，将菌液OD600调至一致到1.8。

固体培养基：10倍梯度稀释，取2 μL点样于非生物胁迫平板(Cd浓度为0，20，30 μmol/L；NaCl浓度为0，250，350 μmol/L)；PEG-6000(浓度为0，20%，25%)，30 ℃培养2 d，观察菌落生长情况，每组试验设置3次重复。

液体培养基SC-U(2%葡萄糖)；取2 μL菌液接种于0.001 mL培养基中(胁迫条件同上)，30 ℃振荡培养36 h，测定菌液OD600值，每组试验设置3次重复，所得数据用SPSS 20进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 SlUDP基因生物信息学分析

2.1.1SlUDP基因的氨基酸序列比对 通过NCBI，检索序列为番茄SlUDP基因的氨基酸序列，获得在马铃薯(Solanum tuberosumL.)、番茄(Lycopersicon esculentumMill.)、拟南芥(Arabidopsis thalialaL.Heynh)、水稻(Oryza sativaL.)等不同植物中的同源基因并进行氨基酸序列比对。结果如图1，SlUDP与番茄、大豆、拟南芥等都有高度的一致性，因此说明SlUDP在多种植物中都有高保守性。

2.1.2SlUDP基因的二级结构预测 通过NCB1来查找SlUDP基因的开放阅读框，其中所翻译的蛋白质有483个氨基酸，编码区长度为1 452 bp,结果如图2所示。将克隆后的SlUDP序列经过生物信息学分析，用SOPMA对SlUDP的蛋白二级结构进行预测，在SlUDP的蛋白二级结构中，α-螺旋占比较高，约为43.06%，延伸链约为13.66%，β-转角比例最少，约为5.8%。

2.1.3SlUDP基因的系统进化树 根据同源性较高的氨基酸序列构建进化树，通过亲缘关系得到SlUDP和其他植物的同源关系。如图3所示，马铃薯、花叶烟草、番茄、甜辣椒、石竹、紫椴为一支；拟南芥为一支；水稻、大豆、玉米为一支。SlUDP与甜辣椒的亲缘关系最近，其次是马铃薯和花叶烟草，支持率达到98%，与玉米的同源关系最远。

2.2 SlUDP基因的表达特性分析

取4月龄番茄的叶、根、主茎、侧茎、花、果实探究SlUDP基因在这些组织中的表达特性。结果如图4，可以看出，SlUDP基因在叶中的表达量是在主茎中表达量的8.4倍，表达量最显著。其次在果实中的表达量是主茎中的5.8倍。根和侧茎的表达量没有显著差异，大约是主茎的3倍。因此，可以看出SlUDP普遍存在于番茄各组织中且存在组织表达差异性，在叶片和果实中表达量较显著，各部位的表达量趋势是叶片>果实>根部>侧茎>主茎>花。

2.3 镉胁迫下SlUDP基因的表达分析

对四叶期番茄进行CdCl2处理，通过荧光定量对SlUDP进行表达量分析。结果如图5所示，随着时间增加，根和叶中SlUDP基因都能响应番茄镉胁迫上调表达。在叶中，与0 d(对照)相比，2 d为对照的17.5倍，最大值为22.1，在5 h出现，上调表达后，除3 d有下降外，其他时间点变化较小。根中SlUDP基因3 d以前表达水平变化不大，4 d以后随时间的增加呈现上升趋势，5 d上升量最为显著，与0 d(对照)相比，为对照的6.2倍。

2.4 番茄SlUDP基因在3种非生物胁迫处理下酵母的表型分析

2.4.1 转SlUDP基因在固体培养基下的酵母表型分析 将pYES2空载体和连接过的含有XbaⅠ、KpnⅠ酶切位点的转SlUDP基因载体分别转入酵母感受态INVSC1中，挑取pYES2-SlUDP和pYES2单菌落于SC-U选择培养基上培养20 h，后转到诱导培养基上振荡培养1 d，将菌液浓度调到OD600=1.8后将稀释倍数不同的菌液点到SC-U培养基上培养，观察其生长情况。结果如图6所示，正常生长情况下，重组酵母和对照酵母的生长无明显差异。Cd处理浓度为30 μmol/L，当菌液浓度稀释到105倍时重组酵母依然能存活而对照不能生长；利用20%，25%PEG-6000处理，20%处理下，重组酵母和对照酵母出现差异，25% PEG-6000处理下，差异更为显著，稀释104时对照酵母不再生长，重组酵母仍有部分存活；NaCl胁迫处理浓度为250，350 μmol/L，重组酵母和对照酵母随着处理浓度的增加都大量死亡，没有表现出显著性差异。由此可见，SlUDP基因能够提高转基因酵母对镉和干旱的耐受性。

2.4.2 转SlUDP基因酵母存活率的测定 进一步对转基因酵母的存活率进行测定，首先挑取酵母感受态细胞INVSC1的pYES2-SlUDP和pYES2单菌落摇菌，对OD600值进行测定，对酵母在Cd、干旱和盐胁迫下进行定量分析。结果如图7所示，随着Cd胁迫浓度的增加，酵母OD600的值不断降低，但pYES2-SlUDP一直高于pYES2，且从高浓度20%开始达到差异显著性。随着Cd胁迫浓度的增加，二者也呈现下降趋势，且pYES2-SlUDP与pYES2相比菌液浓度始终较高，而在不同盐胁迫下，转基因酵母与对照相比存活率的差异不显著。以上结果推测，SlUDP基因可以提高转基因酵母在镉和干旱胁迫下的存活率。

3 讨论

番茄是一种世界性蔬菜，在重金属胁迫下，番茄幼苗生物量、株高、叶绿素均随处理重金属质量比增大而降低[26]，干旱和高盐等非生物胁迫能够影响其萌发、生长发育和产量等[27]。因此，对参与番茄非生物胁迫调控的功能基因进行克隆与鉴定是番茄非生物胁迫研究中的重要组成部分[28]。

本研究从番茄中克隆出UDP-糖基转移酶基因SlUDP。通过荧光定量PCR的分析可以看出SlUDP基因在番茄叶、根、主茎、侧茎、花、果实中存在表达差异性，这与郭军康[1]的研究结果中在番茄根、茎、叶中表达显著一致，而显著部位略有差异。重金属镉处理后通过荧光定量PCR分析结果表明SlUDP基因在叶和根中表达显著，其研究表明SlUDP基因能响应重金属镉胁迫上调表达。本试验通过酵母表达系统结果显示SlUDP基因能响应干旱等非生物胁迫，这与张凤菊[29]研究的糖基转移酶UGT86A1，能够参与干旱胁迫适应，在干旱胁迫下，UGT86A1过表达植株显著上调一致，同时笔者推测SlUDP基因同样能参与番茄抵抗干旱等非生物胁迫。

UDP-糖基转移酶蛋白家族的作用机制和功能是多样的，这是由于作用底物是多样的。酵母表达体系具有较为完善的表达控制系统，能够介导目的蛋白高度表达，由于生物功能进化上的保守性，使其可用于植物、动物、真菌等多种生物基因初步功能验证[30]。通过过表达SlUDP基因于酵母中，观察在固体培养基上菌落的生长，进一步测量液体培养基的OD值，对SlUDP基因在Cd、NaCl和干旱胁迫下的功能进行研究。结果显示，在Cd和干旱胁迫下稀释105倍时对照基本未见菌落生长，而pYES2-SlUDP重组酵母的生长情况较好。这说明SlUDP基因提高了酵母的耐镉和耐干旱胁迫，但是没有提高转基因酵母耐高盐胁迫能力。这与近年来研究的UGT75X[31]、UGT85A5[32]、UGT76C2[33]等均可提高植物耐旱机制一致。由此可见，在不同植物中UDP-糖基转移酶表现相似，能积极响应非生物胁迫。综上，本试验在番茄中克隆得到SlUDP基因，通过荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达以及在镉胁迫下番茄根和叶的表达特征，最后利用酵母表达系统对SlUDP基因在镉等3种非生物胁迫中的作用进行功能验证，初步阐明了SlUDP基因在镉、NaCl、干旱等方面的功能，为SlUDP基因家族参与抵抗番茄非生物胁迫提供理论依据。