解淀粉芽孢杆菌ck-05发酵液的抑菌活性

刘小玉　付登强　刘立云　齐兰

摘要：对解淀粉芽孢杆菌ck-05菌株发酵液中生物活性物质的抑菌作用及稳定性进行初步研究。采用菌丝生长速率法测定菌株ck-05发酵液对11种病原菌的抑菌作用。结果表明，ck-05菌株发酵液对供试植物病原菌均具有较强的抑菌作用，其中对香蕉枯萎病的抑制性最强，抑菌率达82.22%。另外，以香蕉枯萎病为指示菌，测定不同条件下ck-05菌株发酵液的抑菌稳定性。结果表明，发酵液热稳定性较好;对酸碱性条件比较敏感，pH值为6～8时具有较强的抑菌作用;紫外线和自然光照射下稳定性较好，对蛋白酶不敏感。

关键词：解淀粉芽孢杆菌ck-05;抑菌活性;稳定性;生长速率法;香蕉枯萎病;发酵液

中图分类号：S182文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）04-0078-04

作者簡介：刘小玉（1986—），女，江西九江人，硕士，助理研究员，主要从事土壤微生物方面的研究。E-mail：liuxiaoyu06120210@163.com。

近年来，化肥的施用为作物产量的提高做出了突出贡献，但盲目过量施用化肥，造成部分地区植物土传病害日益加重[1]。利用化学药剂防治植物病害会引起诸多副作用，生物防治逐渐成为农业生产中一种新的发展趋势。解淀粉芽孢杆菌具有广泛抗菌能力，属革兰氏阳性芽孢杆菌。有研究表明，解淀粉芽孢杆菌通过产生吲哚-3-乙酸（IAA），分泌葡聚糖酶、几丁质酶以及抗菌活性物质，达到防治植物病害的目的[2-3]。笔者所在课题组在前期工作中获得解淀粉芽孢杆菌菌株ck-05，为进一步将该菌株应用到实际生产中，对该菌株发酵液的抑菌活性及不同条件下的稳定性进行研究，旨在为将该菌株开发为生物农药提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验时间及地点

试验于2019年在海南省文昌市文清大道496号椰子研究所实验室（19°33′12″N，110°47′14″E）开展。

1.2供试菌株及培养基[4]

解淀粉芽孢杆菌ck-05和11种病原菌（槟榔炭疽病、椰子茎腐病、菜心炭疽病、油茶炭疽病、油棕心腐病、椰子灰斑病、板栗疫病、香蕉枯萎病、油茶叶斑病、槟榔心腐病、花生果腐病）均由中国热带农业科学院椰子研究所实验室保藏。

LB（Luria-Bertani）培养基：5g酵母粉，10gNaCl，10g蛋白胨，18～20g琼脂，1L水，pH值为7.0～7.2。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：200g土豆，20g葡萄糖，18～20g琼脂，1L水。

发酵培养基：20g葡萄糖，20g蛋白胨，0.8g无水氯化钙，1.3gK2HPO4，0.2gMgSO4，0.8gMnSO4·H2O，pH为值7.0～7.2。

1.3无菌发酵液的制备[5]

将活化的菌株ck-05接入LB液体培养基中，30℃、200r/min摇床培养24h（D600nm>0.8）为种子液。将种子液分别按体积分数5%接入灭好菌的发酵培养基中，30℃发酵培养48h。发酵液10000r/min离心20min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，得到菌株ck-05无菌发酵液。

1.4ck-05发酵液抑菌谱的测定

将10mLck-05菌株发酵液与90mLPDA培养基混合均匀，制成含菌株ck-05无菌发酵液的培养基平板。分别在平板中央接入11种不同的供试病原菌菌块（5mm），以10mL无菌水为对照（CK）。置于28℃的恒温培养箱中培养，待对照组菌落长满培养皿时，采用十字交叉法测量各处理组菌落直径，并计算无菌滤液的抑菌率[6-7]。

抑菌率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100%。

1.5ck-05发酵液的稳定性测定

1.5.1热稳定性

在40、60、80、100℃条件下，分别将ck-05菌株发酵液处理30、60、120min及121℃灭菌20min[8-9]，测定ck-05无菌发酵液对香蕉枯萎病的抑菌率，CK为不作温度处理的发酵液。待观察并测量各处理组菌落直径，并计算抑菌率，计算方法同上。

1.5.2酸碱稳定性pH值设为1.0～13.0等13个梯度，用HCl和NaOH调整ck-05菌株无菌发酵液的pH值，静置24h后调回发酵液原始pH值（pH值=7.2），测定ck-05无菌发酵液对香蕉枯萎病的抑菌率[9]。

1.5.3紫外线稳定性

将ck-05菌株发酵液置于距离30W紫外灯30cm处，紫外线照射时间分别设为10、20、30、40、50、60min等不同处理，测定ck-05无菌发酵液对香蕉枯萎病的抑菌率[10]。

1.5.4光照稳定性将ck-05菌株无菌发酵液在自然光下照射4、8、12、16、20、24h，测定ck-05无菌发酵液对香蕉枯萎病的抑菌率[10-11]。

1.5.5酶稳定性酶的终质量浓度为50mg/L，温度设为37℃。用胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理ck-05菌株发酵液，分别处理0.5、1.0、1.5、2.0h，测定ck-05无菌发酵液对香蕉枯萎病的抑菌率，得出蛋白酶耐受性[10，12]。

2结果与分析

2.1ck-05菌株无菌发酵液的抑菌谱测定

由表1可知，ck-05菌株发酵液除对菜心炭疽病病菌的抑菌作用为43.47%外，对其他10种供试病原菌的抑菌率均达到50%以上，发酵液对香蕉枯萎病的抑制作用最强，抑菌率达82.22%，其次为花生果腐病病菌和椰子茎腐病病菌，抑菌率分别为79.44%和78.89%。由此可见，ck-05菌株发酵液抗菌范围较广。

2.2ck-05菌株发酵液的热稳定性

以香蕉枯萎病病菌为指示菌，由图1可知，经过不同温度处理后，ck-05菌株发酵液仍具有较强的抑菌作用，热稳定性较好。40、60、80℃处理不同时间后抑菌作用无明显变化，但温度高于80℃处理后发酵液抑菌活性明显下降，100℃高温处理120min后发酵液抑菌率为31.48%，经121℃高压蒸汽灭菌后发酵液抑菌率仅为19.26%。当温度达到100℃后，ck-05菌株发酵液的抑菌率明显降低，这可能是由于高温能够使其抑菌活性物质结构发生变化，导致活性物质变性失活，最终使发酵液抑菌活性下降。

2.3ck-05菌株发酵液的酸碱稳定性

由图2可知，ck-05菌株发酵液的抑菌活性对pH值较敏感。pH值为7时，其发酵液抑菌活性最大，pH值为5时，抑菌率为44.44%;pH值为3时，抑菌率为27.41%，pH值为1时，抑菌率仅为10.00%，与对照组CK相比分别下降34.43%、59.56%、85.25%，pH值为9时，抑菌率为50.00%、pH值为11时，抑菌率为22.59%;pH值为13时，抑菌率仅为7.78%，與对照CK相比分别下降26.23%、66.67%、88.52%。

2.4ck-05菌株发酵液的紫外线照射稳定性

紫外线照射稳定性是抑菌活性物质开发药品、食品防腐剂的重要指标，若紫外稳定性差将会降低药效[13]。由图3可知，与对照CK相比，经紫外线照射30min内，ck-05菌株发酵液抑菌率下降较小;40min后随着紫外线照射时间不断延长，抑菌活性明显降低，但紫外线照射60min时其抑菌率仍在40%以上。由此可知，ck-05菌株发酵液的抑菌活性受紫外线照射的影响较小，该结果与葛平华等的报道[8]一致。

2.5ck-05菌株发酵液的自然光照稳定性

由图4可知，ck-05菌株发酵液在自然光照射0～24h后，其抑菌活性均无明显变化。当持续光照24h后，ck-05菌株发酵液仍具有较强的抑菌活性，抑菌率为64.81%，与CK相比，其抑菌率变化不明显，由此可见，ck-05菌株发酵液的抑菌活性受自然光照的影响较小。

2.6ck-05菌株发酵液的蛋白酶稳定性

由图5可知，不同蛋白酶对ck-05菌株发酵液的抑菌活性影响不明显，说明其发酵液的抑菌作用对3种供试蛋白酶均不敏感。

3讨论与结论

李杨等研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌ZJ01对苹果轮纹病病菌有较强的抑制作用[14]。王晓辉等认为解淀粉芽孢杆菌K1发酵液可有效抑制灰霉病病菌的生长[15]。Caldeira等认为，菌株CCMI1051能较强地抑制哈茨木霉及根霉生长，抑菌作用分别为74.7%、99.8%[16]。张宝俊等从解淀粉芽孢杆菌LP-5中获得1种对梨黑斑病病菌具有较强抑制作用的抗菌蛋白[17]。EvaArrebola等研究表明，菌株PPCB004能有效抑制青霉属真菌的菌丝生长，其中对壳青霉菌的抑菌率达73.3%[18]。解淀粉芽孢杆菌的抑菌机制表现在不同的方面，不同的菌株其抑菌机制可能不同，但主要是产生抑菌活性物质。抑菌活性物质主要有甜蛋白、抗生素肽类物质、伊枯草菌素、芬枯草菌素、表面活性素、几丁质酶、芽孢素类和细菌素等[19]。本研究发现，解淀粉芽孢杆菌ck-05发酵液对11种供试植物病原菌的菌丝生长均具有较强的抑制作用，尤其是对香蕉枯萎病的抑菌作用最强，抑制率达82.22%。以香蕉枯萎病病菌为指示菌，ck-05菌株发酵液在温度低于80℃时具有较好的热稳定性;对酸碱性条件比较敏感，pH值为6～8时具有较强的抑菌作用;紫外线和自然光照射下稳定性较好，对蛋白酶不敏感。该菌株发挥抑菌作用的具体活性物质及抑菌机制还有待进一步研究。

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