圆支清疫苗中猪圆环病毒2型对猪肺炎支原体的免疫增强作用

车巧林， 董彦鹏，刘茂军，耿晓眉，缪芬芳

(1. 江苏南农高科技股份有限公司，江苏 江阴 214400；2. 江苏省农科院兽医研究所，江苏 南京 210014)

猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo)是引起猪支原体肺炎的主要病原，在猪呼吸道疾病综合征(PRDC)发生过程中起着重要作用。20世纪90年代后期，北美和欧洲出现了猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)[1-2]。PCV2感染后除引起仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)外，还引起猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍、新生仔猪先天性震颤(CT)、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等[3-4]。单独Mhyo或PCV2感染并不足以引起疾病的临床表现，但是并发或继发其他细菌或病毒感染时，可使死亡率大大提高。

Mhyo与PCV2之间存在协同感染，Mhyo可以增强PCV2相关性肺损伤的严重性，增加PCV2在组织中的数量和分布[5]。对4周龄的断奶仔猪进行Mhyo攻毒，6周龄时再用PCV2攻毒，结果猪表现出严重的呼吸道疾病，血清中PCV2 的拷贝数显著上升, 病毒血症持续期延长，肺组织和淋巴组织的病理损伤比单独Mhyo或PCV2感染时严重[6]。

迄今为止，对病原之间共感染的研究比较多，但是对联苗各抗原之间的相互作用研究甚少。本研究用3组相同Mhyo抗原含量、不同PCV2抗原含量的圆支二联疫苗和1组相同Mhyo抗原含量的单苗分别免疫BALB/c小鼠、新西兰大耳白兔和健康仔猪，测定血清中PCV2抗体和Mhyo抗体，并在仔猪二免后进行Mhyo强毒攻击，观察肺部病变程度，阐明PCV2与Mhyo抗原之间的免疫协同关系。

1 材料与方法

1.1 菌株、毒株和细胞

Mhyo HN0613株(代次F6)和PCV2 SH株，PK15-B1克隆细胞，均由江苏南农高科技股份有限公司鉴定并保存。

1.2 主要试剂

MEM干粉培养基购自Gibco Invitrogen公司；Friis培养基由江苏南农高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA),购自 Sigma Aldrich 公司；无水硫代硫酸钠购自Alfa Aesar 公司；β-丙内酯购自Serva公司；猪支原体肺炎ELISA抗体检测试剂盒购自 IDEXX 公司；PCV2抗体检测试剂盒购自BioChck公司；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自生工公司；Mhyo微量间接血凝(IHA)检测试剂盒由江苏南农高科技股份有限公司自制。

1.3 试验动物

16～18 g健康雌性BALB/c小鼠，PCV2 ELISA抗体阴性(效价<1∶50)；1～1.5 kg新西兰大耳白兔，Mhyo IHA抗体阴性(效价<1∶5)；21日龄健康仔猪，PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原阴性，PCV2、Mhyo ELISA母源抗体阴性。

1.4 Mhyo菌液的制备及灭活

Mhyo HN0613株F6代冻干菌种用2 mL Friis培养基溶解，以10%比例接种于含20 mL Friis培养基的100 mL盐水瓶中，37 ℃恒温培养箱中静置培养至pH=6.7～6.8时收获。收获的菌液以5%比例接种于含400 mL Friis培养基的三角瓶中，120 r/min、37 ℃恒温振荡培养，待pH值下降到6.7～6.8时收获。收获菌液测定颜色变化单位(CCU)。

向Mhyo菌液中加入过滤除菌的0.1 mol/L的BEI溶液，使终浓度为4 mmol/L，37℃恒温振荡24 h后加入终浓度为10 mmol/L的硫代硫酸钠溶液，37 ℃恒温振荡1 h终止灭活。取1 mL灭活菌液接种50 mL Friis液体培养基进行灭活检验，37 ℃培养5 d后再取0.5 mL培养物移植到4.5 mL Friis液体培养基，37 ℃继续培养观察10 d。

1.5 PCV2病毒液的制备及灭活

从细胞库中取出冻存的PK15-B1克隆细胞复苏，加入含10%新生牛血清的MEM培养液，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养24～48 h。当其长成良好单层时，弃去培养液，加入EDTA-胰酶细胞分散液消化，按1∶2～1∶3比例传代增殖培养。将扩大培养的细胞接种到细胞转瓶中，转速为10～12 r/h，置36～37 ℃培养24～48 h。当转瓶细胞形成良好单层时，按1∶2～1∶3比例传代继续扩大培养1次，待转瓶细胞形成良好单层时，按5%接种PCV2 SH毒种，置37 ℃下吸附30 min，加入细胞维持液，置37 ℃下旋转培养，转速为10～12 r/h，每日观察1～2次，细胞应生长良好，37 ℃下培养4 d，置-20 ℃下反复冻融2～3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定。

向PCV2病毒液中加入终浓度0.1%的β-丙内酯，4 ℃振荡灭活30 h，37 ℃恒温振荡水解2 h。取少量灭活病毒液进行灭活检验，即少量病毒液接种已长成单层的PK15-B1克隆细胞，置37 ℃下吸附1 h，弃去病毒液，加入新的细胞维持液，置37 ℃下继续培养2 d，应无细胞病变(CPE)，连续盲传3代后，用免疫荧光法(IFA)检测。

1.6 PCV2病毒液的浓缩及Western blot检测

PCV2灭活抗原经300 kDa的中空纤维膜超滤柱分别进行2倍和3倍浓缩。浓缩后的抗原进行SDS-PAGE分析。电泳结束后将未染色的凝胶、裁减好的NC膜夹于滤纸之间，按照负极-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-正极的顺序放入装有电转液的电泳槽，200 mA恒流转印80 min。转印结束后，NC膜放入丽春红染色液中染色1～2 min，PBS洗去丽春红染液。NC膜清洗干净后，放入5%脱脂乳PBS中4 ℃过夜封闭，TBST洗涤2次。加入1∶1 000稀释的3E5单抗(PCV2单抗，南京农业大学动物医学院制备)，室温孵育2 h，TBST洗涤5次，再加入1∶2 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，TBST洗涤5次，化学发光试剂盒显色10 s～1 min，化学发光仪显影0.5～20 s，拍照。

1.7 灭活疫苗的制备

未经浓缩的PCV2抗原、浓缩2倍和3倍的PCV2抗原分别与Mhyo抗原以5∶4比例混匀，低速搅拌10 min，再与Gel佐剂(Seppic公司)以9∶1的比例混合，低速搅拌20 min，NaOH溶液调节pH值至6.2～6.3，分装，每瓶20 mL。

生理盐水与Mhyo抗原以5∶4比例混匀，再与Gel佐剂以9∶1比例混合，低速搅拌20 min，配制1组只含Mhyo抗原的疫苗。疫苗各组分见表1，配制的疫苗进行无菌检验。

表1 灭活疫苗组别及各组分用量

1.8 替代动物免疫及血清抗体水平检测

1.8.1 BALB/c小鼠免疫及血清抗体ELISA检测

选取16～18 g PCV2 ELISA抗体阴性(效价低于1∶50)的健康雌性BALB/c小鼠25只，随机分成5组，每组5只。第1～4组分别皮下接种猪支原体肺炎单苗，圆支二联疫苗1、2和3，每只0.2 mL，14 d后按相同途径和剂量进行二免；第5组不接种，作为空白对照。各组小鼠均隔离饲养、观察。二免后21 d采血，分离血清，用自制的小鼠血清间接ELISA试剂盒测定小鼠血清中的PCV2 ELISA抗体效价。

1.8.2 家兔免疫及血清抗体IHA测定

1～1.5 kg Mhyo IHA抗体阴性(效价低于1∶5)的健康新西兰大耳白兔25只，随机分成5组，每组5只。第1～4组每只后腿肌肉注射猪支原体肺炎单苗，圆支二联疫苗1、2和3，每只0.5 mL，第5组不免疫，作空白对照。免疫后28 d采血，分离血清，测定兔血清中Mhyo IHA抗体效价。

1.9 本体动物免疫、攻毒、血清抗体及PCV2抗原检测

1.9.1 仔猪免疫及攻毒

25头21日龄健康易感仔猪随机分成5组，每组5头。第1～4组分别颈部肌肉注射猪支原体肺炎单苗，圆支二联疫苗1、2和3，每头猪注射1头份(2 mL)，第5组每头注射不含抗原成分、只由培养液和佐剂配制的安慰剂2 mL，作为攻毒对照组。疫苗接种组及攻毒对照组首免后14 d加强免疫1次，免疫剂量为2 mL/头。二免后28 d，所有试验组猪气管注射Mhyo济南系强毒10 mL(含100个最小发病剂量)，连续观察28 d，剖杀取肺。

1.9.2 仔猪血清抗体检测

所有仔猪在首免当天接种前及首免后14 d(二免接种前)、28 d、42 d(攻毒前)、56 d、70 d(剖杀前)分别采血，分离血清，Mhyo血清抗体采用 IDEXX间接ELISA抗体检测试剂盒和自制的微量间接血凝检测试剂盒进行检测，PCV2血清抗体采用BioChek 间接ELISA抗体检测试剂盒进行检测。

1.9.3 仔猪攻毒后肺部病变情况

Mhyo济南系强毒攻击后28 d剖杀所有试验猪，按照28分法对试验猪的肺炎病变进行评分[7]。分别对免疫组猪和对照组猪进行打分，按照以下公式计算肺部病变减少率：

1.9.4 仔猪血清及肺组织PCV2 抗原检测

所有仔猪首免后14、28、42、56、70 d采血分离的血清，70 d剖杀时采集的肺组织按照Ezup 柱式病毒 DNA 抽提试剂盒操作步骤提取 DNA，用PCV2特异性引物进行PCR扩增。引物序列为：PCV2-F：5′-TTC GGT ACC AGC TAT GAC GTA TCC AAG-3′，PCV2-R：5′-GCC AAG CTT TCA CTT CGT AAT GGT TTT-3′。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 Mhyo菌液的制备及灭活

收获的Mhyo菌液CCU测定结果为109CCU/mL，经终浓度4 mmol/L BEI灭活24 h后进行灭活检验，2次培养物均不变色，说明灭活彻底。

2.2 PCV2病毒液的制备及灭活

收获的PCV2病毒液含量为106.5TCID50/mL，少量灭活病毒液接种PK15-B1克隆细胞连续盲传3代，IFA法检测无绿色荧光着染的PCV2阳性细胞，说明病毒液灭活彻底。

2.3 PCV2病毒液的Western blot检测

未经浓缩的PCV2灭活抗原，经中空纤维膜浓缩2倍、3倍的灭活抗原同时进行Western blot检测，在27 kDa左右有条带，说明有明显的免疫反应性，并且条带随着浓缩倍数的增加而变粗，见图1。

2.4 小鼠血清PCV2抗体ELISA检测

5个试验组的小鼠全部采血并分离血清，用自制的小鼠血清间接ELISA试剂盒测定血清中PCV2抗体效价。同稀释度待检血清OD450 nm值/阴性血清OD450 nm值(P/N值)不低于2.1时判为阳性，以P/N值不低于2.1的血清最大稀释度作为该血清的ELISA抗体效价。小鼠血清中PCV2 ELISA抗体效价不高于1∶50，判为阴性；高于1∶50，判为阳性。小鼠血清PCV2 ELISA抗体效价结果见表2，由表2可以看出，猪支原体肺炎单苗组与空白对照组PCV2抗体均呈阴性，圆支二联疫苗1、2和3免疫小鼠产生的PCV2抗体效价随着圆环病毒含量的增加而增加。

M.预染Marker；1.浓缩3倍的PCV2抗原；2.浓缩2倍的PCV2抗原；3.不浓缩的PCV2抗原

表2 小鼠血清PCV2 ELISA抗体检测结果

2.5 兔血清Mhyo IHA抗体效价测定

5个试验组的兔子全部采血并分离血清，用IHA测定血清中Mhyo抗体效价。结果见表3，由表3可以看出，空白对照组Mhyo抗体为阴性，猪支原体肺炎单苗组平均效价为1∶88，相同Mhyo含量、不同PCV2含量的圆支二联疫苗1、2和3免疫兔子产生的Mhyo抗体效价随着PCV2含量的增加而提高，这说明PCV2全病毒可能对Mhyo的免疫有增强作用。

表3 兔血清Mhyo IHA抗体测定结果

2.6 仔猪血清抗体检测

仔猪血清PCV2抗体检测结果见表4，从表4可以看出圆支二联疫苗3在首免后14 d PCV2抗体转为阳性，在首免后56 d达到高峰，首免后70 d开始下降；圆支二联疫苗1和圆支二联疫苗2在首免后28 d(即二免后14 d)PCV2抗体转为阳性，在首免后42 d 至70 d PCV2抗体处于一个稳定期；猪支原体肺炎单苗组和攻毒对照组在整个检测期间PCV2抗体均呈阴性。综合各组PCV2抗体水平结果，说明疫苗中PCV2抗原含量越高，猪PCV2血清抗体越早转化成阳性，且达到的抗体水平也越高。

仔猪血清Mhyo ELISA 抗体检测结果见表5，从表中可以看出所有免疫组在首免后28 d(即二免后14 d) Mhyo抗体转为阳性，且抗体在持续上升，首免42 d采血结束后进行Mhyo强毒攻击，攻毒后所有组别Mhyo抗体水平在上升，攻毒对照组在攻毒后28 d抗体转为阳性。免疫组别中，随着疫苗中PCV2抗原含量的增加，免疫后Myho抗体水平也在提高，说明PCV2抗原对Mhyo抗体的产生有促进作用。

表4 仔猪血清PCV2 ELISA抗体检测结果(S/P值)

表5 仔猪血清Mhyo ELISA抗体检测结果(S/P值)

仔猪血清Mhyo IHA检测结果见表6，从表中可以看出IHA检测结果与ELISA检测结果基本一致，只有首免后28 d Mhyo抗体有所差别，猪支原体肺炎单苗组和圆支二联疫苗1组首免后28 d(即二免后14 d)Mhyo抗体效价>1∶5，可疑；圆支二联疫苗2组和圆支二联疫苗3组 Mhyo抗体转为阳性，大于1∶10。Mhyo IHA检测结果同样说明PCV2抗原对Myho抗体的产生有促进作用。

表6 仔猪血清Mhyo IHA抗体效价检测结果

2.7 仔猪肺部病变情况

Mhyo济南系强毒攻击后，采用28分法评分，结果如下：攻毒对照组肺部病变平均得分最高，为12.8，猪支原体肺炎单苗组、圆支二联疫苗1、2和3组肺部病变平均得分依次降低，肺部病变减少率依次升高，且圆支二联疫苗2和圆支二联疫苗3肺部病变减少率均在80%以上(结果见表7)。这说明圆支二联疫苗中PCV2抗原对Mhyo免疫有增强作用，且随着PCV2全病毒抗原含量的增加，免疫保护效果随之增强。部分猪的病变情况见图2。

表7 各组肺部病变评分及肺部病变减少率

A.猪支原体肺炎单苗组; B.圆支二联疫苗1组;C.圆支二联疫苗2组;D.圆支二联疫苗3组;E、F.攻毒对照组，其中：箭头指示有病变的地方

2.8 仔猪血清及肺组织PCV2抗原检测

所有仔猪首免后14、28、42、56和70 d采血分离的血清，70 d剖杀时采集的肺组织用PCV2特异性引物进行PCR扩增，所有血清及肺组织样品在751 bp处均没有出现特异性条带(部分血清及肺组织PCR结果见图3)，这说明在仔猪的整个试验过程中未受到野毒PCV2的感染。

M.Marker；+.阳性对照；-.阴性对照；1～5.猪支原体肺炎单苗组;6～10.圆支二联疫苗1组;11～15.圆支二联疫苗2组;16～20.圆支二联疫苗3组;21～25.攻毒对照组

3 讨论

在前期研究中，用Mhyo抗原含量相同、PCV2抗原含量不同的2组圆支二联疫苗免疫新西兰大耳白兔，结果发现圆环病毒经过中空纤维浓缩后含量高的圆支二联疫苗组Mhyo抗体效价更高，且同样经过中空纤维浓缩，不含圆环病毒抗原的MEM培养基与不含Mhyo抗原的Friis培养基配制的疫苗，免疫后未检测到Mhyo抗体；Mhyo抗原含量高、圆环病毒含量低和Mhyo抗原含量低、圆环病毒含量高的2组圆支二联疫苗免疫新西兰大耳白兔，结果后者免疫后产生的Mhyo抗体效价反而比前者免疫后产生的抗体效价高。由这2个试验结果猜测PCV2全病毒可能对Mhyo免疫具有促进作用，因此设计本研究进行验证。

本研究结果进一步证实，PCV2全病毒对Mhyo的免疫具有促进作用，这可能与PCV2基因组内含有的CpG基序(CpG-寡聚脱氧核苷酸序列，简称CpG-ONG)有关。PCV2基因组中至少含有18个CpG基序，并且在猪外周血单核细胞培养物中能诱导IFN-α 的产生[8]。在体外条件下，利用与PCV2不相关的CpG-ONG序列也能诱导白细胞介素2(IL-2)、IL-10或γ干扰素(IFN-γ)的产生[9]。Opriessnig等[6]在研究Mhyo与PCV2之间的关系时，得到了类似的结果，即先后感染Mhyo和PCV2的猪产生的Mhyo血清ELISA抗体水平显著高于只感染Mhyo的猪产生的ELISA抗体水平。

另外，Yim等[10]发现支气管败血波氏杆菌抗原对Mhyo的免疫也具有促进作用，接种支气管败血波氏杆菌抗原和Mhyo抗原的小鼠产生的Mhyo特异性IgG高于只接种Mhyo抗原小鼠产生的特异性IgG。Thacker等[11-12]揭示了Mhyo与PRRSV、猪流感病毒(SIV)发生共感染时可以增加Mhyo抗体水平。这些结果提示了Mhyo联苗的免疫效果可能优于猪支原体肺炎单苗。