冷冻保存20年的湖羊胚胎移植复苏与利用

刘莉君，章晓炜，马敏彪，刘雅丽，白慧琴，朱芳贤

(1. 浙江畜牧技术推广总站，浙江 杭州 310021；2. 浙江华丽牧业有限公司，浙江 杭州 311116；3. 全国畜牧总站，北京 100193)

湖羊是世界著名的多羔绵羊品种，具有性成熟早、繁殖力高、四季发情、前期生长速度较快、耐湿热、耐粗饲、宜舍饲、适应性强等优良性状，尤其是多羔性的遗传性能稳定，携带FceB基因，所产羔皮花案美丽，肉质细嫩、鲜美、膻味少[1]。近几年，西部省份陆续引进湖羊对当地绵羊进行杂交改良，证实湖羊不仅适应主产区江南湿热气候和密集舍饲条件，在引入新疆、甘肃等气候干燥、冬季寒冷的大西北地区后也能正常生长繁育[2-5]。

但目前，因市场产品需求结构的调整和对湖羊开发利用的不合理，不同程度出现近亲繁殖、种质退化、羔皮品质变差和产羔率下降等问题[6-7]，直接影响了湖羊产业的经济效益和可持续发展。现有的湖羊保种以数家原种场饲养纯种湖羊为主，保种形式单一、成本高、安全性保障不够，很难保证种质稳定性，迫切需要探索其他保种方式和途径。

为了检验20多年前湖羊冷冻胚胎的制作、保存质量，评价生物保种的效果，同时为保种场扩充血缘，对国家家畜基因库提供的上世纪八九十年代保存4个血统的24枚冷冻胚胎，在国家级湖羊保种场浙江华丽牧业有限公司进行复苏利用，对胚胎羊开展性能测定，检验湖羊冷冻胚胎长期保存及复苏利用的效果。

1 材料与方法

1.1 冷冻胚胎

保存于国家家畜基因库中的4个血统共24枚胚胎，包括：1998年于浙江余杭湖羊场制作的公247与母664组合和公285与母659组合各6枚；1999年于浙江吴兴种羊场制作的公8与母808组合和公4与母704组合各6枚。

1.2 试验用羊

2018年3月初开始受体羊选择并单独组群。受体羊：为了更好地进行胚胎移植后代与目前的湖羊对照，受体选择国家级保种场的湖羊，其年龄在2～4胎、遗传背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)的空怀母羊9只；对照组羊：选择健康、系谱记录完整、品种特征明显、繁殖力强且已开始配种的3个血统公羊6只，选择年龄在2～4胎、遗传背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)母羊20只，采用自然交配方式受孕。

1.3 主要试剂

孕酮阴道栓(CIDR)，新西兰DEC国际有限公司生产，1.9 g/支，批号2017.11.20；氯前列烯醇(PG)，上海市计划生育科学研究所生产，每支0.2 mg，批号2017.06.13；孕马血清促性腺激素(PMSG)，宁波三生药业有限公司生产，1 000万U/支，批号2016.12.15。

1.4 受体羊同期发情处理

采用CIDR+PG+PMSG同期化处理。放栓日为第1天，放栓后第12天撤栓，同时注射PG 1支(0.2 mg)、PMSG 300 U，撤栓后24 h观察发情(用试情公羊试)。

1.5 胚胎解冻和鉴定

从液氮罐中取出装有胚胎的细管，室温下空气浴10 s后投入32～35 ℃水浴中2 min。用消毒卫生纸擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿中，然后将胚胎依次移入6%、3%、0%甘油的0.1 mol/L蔗糖PBS解冻液中，分别停留5 min，最后用保存液洗3次，镜检。

发育正常的胚胎，其卵裂球轮廓清晰，明暗度适中，细胞密度大，卵裂均匀，细胞变性率不超过10%为A级；胚龄与发育期基本吻合，轮廓清晰，明暗适中或稍暗或稍淡，细胞密度较小或小型卵型球过多，细胞变性率10%～20%为B级；轮廓不清晰，色泽过暗或者过淡，细胞密度小，细胞变性率为30%～40%为C级；退化胚、变性胚为D级。

1.6 胚胎移植

2018年4月11—12日进行胚胎移植。受体羊术前需空腹12～24 h，仰卧或侧卧于手术保定架上，肌注0.5 mL的2%静松灵。将羊手术架后端提高。刀口位置左侧在距两侧乳房的10～15 cm用刀片切开2个小口，通过腹腔内窥镜探头，观察卵巢上黄体的变化以确定可否移植。每个受体移植2～3枚胚胎。

1.7 妊娠检查

移植前4周开始加强饲养管理，术后当天给水及草料，第2天放回羊舍，每天观察并记录，增强营养。 2018年6月4—5日，对29只试验母羊开展B超妊娠检查，并对确认怀孕的母羊个体进行拍照存档。8月24日，再次确认妊娠结果，并补拍了怀孕母羊个体照片。

1.8 初生羔羊体型外貌鉴定和等级评定

根据GB 4631—2006[8]对 2018年8月29日—9月14日陆续出生羔羊的花纹类型、花纹面积、花纹宽度、毛长、花纹紧密度、羔皮等级进行鉴定并给予等级评定。

1.9 配种

2019年6月25日起，通过家系全覆盖，同质选配，公羊在品质和等级方面不低于母羊的原则，对胚胎羊进行交叉配种。

1.10 数据统计与分析

数据采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组间采用 Duncan氏法多重比较进行差异显著性检验。以P<0.05作为差异显著的标准，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 胚胎形态鉴定、移植及复苏

共解冻胚胎24枚，其中：1级胚胎8枚，2级胚胎8枚，3级胚胎3枚，4级胚胎3枚。按3级以上为有效胚胎计，冷冻胚胎恢复利用率达到79.2% (19/24)，1级胚胎率达到33.3%(见图1)。对9只符合移植的受体母羊进行移植，6只怀孕分娩，受胎率为66.67%；共移植胚胎22枚，出生9只羔羊，胚胎移植产羔率41%。

A. ♀659×♂285；B. ♀664×♂247；C. ♀808×♂8； D. ♀704×♂4，其中：2～6、9～11为A级胚，1、7～8、12、14～18为B级胚，19、21～24为C级胚，13、20为D级胚

2.2 冷冻胚胎复苏繁育羊性能测定

出生冷冻胚胎复苏繁育羊(以下简称胚胎羊)9只，成活8只(4公4母)，成活率88.89%，其中1只为胎产3羔之一体弱而死，成活羊健康状况良好。从表1可以看出，8只胚胎羊均具有波形花纹且面积都在2/4以上，甲级羔皮等级率为37.5%，6只达到了等级评定的标准；对分属于不同家系的3只公羊与4只母羊进行交配，生产9只羔羊，成活8只，公母羊繁殖性能均正常。

表2中，公羊和母羊初生重都显著高于对照组(P<0.05)，母羊断奶重极显著高于对照组(P<0.01),公羊6月龄体重和体长显著高于对照组(P<0.05)，其他体重和体尺指标和对照组没有差异。

对胚胎羊后代进行了初生体型外貌评定，从表3可以看出，6只羔羊体型外貌特征均符合国家标准，等级评定1级以上的有3只。表4中，后代母羊组初生重显著低于胚胎羊(P<0.01)，甲级羔皮等级率为50.00%。

表1 8只胚胎羊初生体型外貌评定

表2 胚胎羊与对照组羊生长性能比较

表3 胚胎羊后代初生体型外貌评定

表4 胚胎羊与其后代羊对比

3 讨论

3.1 胚胎形态鉴定、移植及复苏

胚胎超低温冷冻保存的原理是在极低的温度(液氮-196 ℃)下保存动物胚胎。处于超低温下的胚胎，其新陈代谢几乎完全停止，因而可以达到长期保存的目的。自Whittingham等1972年最早报道小鼠胚胎在-196 ℃和-269 ℃条件下冷冻保存获得成功以来，人们先后在牛(Wilt和Rowson，1973)、绵羊(Willadsem等，1976)、山羊(Bilton和Moor，1976)、马(Yamamoto，1982)、猪(Hayashi等，1989；Kameyama，1990)等试验动物以及羚羊、狗、狒狒、猴和人上获得成功，并得到移植后代[9-10]。1998年，朱士恩等[11]将小鼠扩张囊胚分别在液氮中冷冻保存1 h、1年和2年，解冻后囊胚形态学恢复率分别为100%、98%和98%，该研究说明保存时间对胚胎活力没有显著影响。本试验的冷冻胚胎恢复利用率达到91.67%，1级胚胎率达到33.3%，也印证了这一点。本次试验胚胎冷冻时间20年，是国内冻存时间最长的，试验结果证实湖羊冷冻胚胎保存20年后再移植，仍然取得很好的妊娠效果。胚胎冷冻保存超过10年后移植在中国还未见报道，1974年，Whittingham等报道对小鼠胚胎的长期冷冻试验，将小鼠胚胎的冷冻时间延长到8个月，并对胚胎进行异地移植，获得成功。1994年，王光亚等[12]对奶山羊的胚胎进行长期冷冻保存试验，将冷冻保存的时间延长到819 d，并成功获得成活羔羊。2011年，尹海科等[13]报道对冷冻8年的布尔山羊胚胎移植成功。

3.2 胚胎羊适应性

本次试验对胚胎羊进行了初生鉴定、生长发育及繁殖性能等测定发现，初生重与对照组羔羊初生重差异较明显，是因为胚胎移植羊胎产羔羊数少、初生体重大的原因。胚胎羊6月龄体重和体尺高于对照组，可能也是胚胎移植羊胎产羔羊数少，初生体重、体型就稍大，同等营养水平生长下，体重、体型一直略微高于对照组。总之，胚胎羊各项体重和体尺指标与对照组生长发育一致，至6月龄无死亡、健康无病，以及4只母羊均成功怀孕并产羔，同胞胎数双胎以上75%，同胞数基本符合湖羊多胎的特性，后代初生重正常，健康状况良好，这些都说明胚胎羊适应性正常。从胚胎移植羊及后代等级评定情况看，1级以上等级占比高于目前湖羊种羊整体情况，同时我们分析了1989年保种场湖羊的甲级羔皮率，也是34%，而胚胎羊是37.5%，表明冷冻胚胎保持了当年湖羊的特性。

4 结论

本研究对保存20年的湖羊胚胎进行复苏，并连续跟踪近2年，对胚胎羊生长、繁殖性能进行测定，发现冷冻达20年湖羊的胚胎经解冻移植复苏后，仍有很好的复苏率，其生长发育、生产性能及繁殖性能与自然交配的湖羊基本保持一致，体型外貌鉴定符合纯种湖羊特征，保持了湖羊原来的特征。研究证实了湖羊胚胎制作、复苏、利用技术应用取得预期效果，这是畜禽保种技术和保种方法的重大突破，对地方品种遗传资源的保种具有深远意义，说明了生物保种是可行的。