先天性巨结肠患者血清miR-223与炎性因子水平及其临床意义研究

陈宏坤 张大森

先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HD)又称为肠管无神经节细胞症，是一种常见的小儿先天性消化道畸形，其发病率为1/5 000，男女比例约4∶1，发病年龄主要集中在出生后几个月[1]。目前HD的主要治疗方法是手术，多数患者术后生存率和生活质量均得到一定提高，但是部分患者术后会出现小肠结肠炎(Hirschsprung associated enterocolitis,HAEC)，据统计造成HD患者死亡的主要原因为巨结肠性小肠结肠炎，其发病率高达42%，严重影响患者生活质量并威胁患者生命安全[2，3]。HD及术后HAEC的发病机制尚不明确，miRNA是一类单链非编码RNA，其在肠黏膜炎症反应、机体免疫、肿瘤形成以及肠上皮细胞增殖与凋亡等方面均产生重要影响。Neudecker等[4]发现miR-223可通过抑制炎症反应来调节肠道炎症。Wang等[5]研究表明，在坏死性小肠结肠炎患者中miR-223作为促炎因子呈高表达，并进一步引起肠道的炎症及免疫反应。目前，国内关于HD与miR-223及相关炎症因子的研究仍未有涉及。因此，本研究探讨HD患者血清miR-223与炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)水平及其临床意义。

材料与方法

一、一般资料

选取2017年1月至2018年8月在枣庄市立医院行HD根治术的患者作为研究对象。纳入标准： ①经临床症状初步诊断、查体与钡剂灌肠提示HD，并经术后病理证实； ②均行一期根治手术(包括 Soave 术和Ikedasoper术)； ③术前未出现HAEC； ④获得患者监护人的知情同意。排除标准： ①合并恶性肿瘤； ②合并严重心、肝、肾等脏器疾病； ③合并其他感染性疾病； ④临床资料不完整。本研究经医院医学伦理委员会批准。最终纳入66例HD患者作为观察组。同时参照HD患者基线资料选取同时期健康患者70例作为健康组。观察组和健康组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明两组具有可比性，见表1。

表1 观察组和健康组一般资料比较Table 1 Comparison of general profiles between observation and healthy groups分组n性别(男/女)年龄[岁,(x±s)]BMI[kg/m2,(x±s)]健康组7053/171.10±0.3616.20±2.09观察组6650/160.95±0.3016.17±2.06t/χ2值-0.5691.6900.084P值-0.4510.0930.933

二、检测方法

入院时抽取患者静脉血约5 mL，离心(3 500 r/min,15 min)后取上层清液。常规生化检测白细胞(white blood cell,WBC)、红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白(Hemoglobin,HGB)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLO)、前白蛋白(Prealbumin,PA)。采用酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-6、IL-8水平，实验操作严格按照说明书(上海酶联生物科技有限公司)执行。应用总RNA提取试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)提取总RNA，并同时检测其吸光度值。取2 μg总RNA置于反转录试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)中合成cDNA，采用PCR仪将cDNA进行扩增。反应条件为：94℃ 10 min预变；94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 45 s，40个循环。用2-ΔΔCt表示患者血清中miR-223的相对表达量。

三、术后随访及HAEC诊断评分系统

由Park等[6]提出，评估HD相关性HAEC项目包括：临床病史、体格检查、影像学检查(腹部立位X线片)、食盐水检查(白细胞以及有无核转移)等。术后随访6个月，随访截止时间为2019年2月28日，HAEC评分≥10分即诊断为HD相关性HAEC，HAEC评分<10分表示患者术后未出现HAEC。根据术后随访是否出现HAEC将观察组患者分为HAEC组和非HAEC组。对比分析两组患者手术年龄、性别、术前身体质量指数(body mass index,BMI)、巨结肠类型、术前相关生化指标(WBC、RBC、HGB、ALB、GLO、PA)、术前TNF-α、IL-6、IL-8等相关因素。

四、统计学方法

结 果

一、观察组和健康组血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8比较

观察组患者血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

二、HD患者术后发生HAEC的单因素分析

随访期间无一例失访，亦无一例死亡。观察组66例患者中有20例(30.30%)术后出现HAEC，即非HAEC组46例和HAEC组20例。经单因素分析显示，HAEC组患者血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8高于非HAEC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 观察组和健康组血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8比较(x±s)Table 2 Comparison of serum levels of mir-223,TNF-α,IL-6 and IL-8 between observation and healthy groups(x±s)分组例数miR-223相对表达量TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-8(pg/mL)观察组663.86±0.8544.20±10.6632.40±8.6618.70±5.02健康组700.80±0.147.06±2.089.88±2.566.84±1.66t值-29.7028.5820.8218.70P值-<0.001<0.001<0.001<0.001

表3 HD患者术后发生HAEC的单因素分析Table 3 Univariate analysis of postoperative HAEC in HD children因素非HAEC组(n=46)HAEC组(n=20)χ2/t值P值手术年龄[n(%)]<1岁1～3岁>3岁27(71.05)12(66.67)7(70.00)11(28.95)6(33.33)3(30.00)0.1120.946性别[n(%)]男女35(87.50)11(68.75)15(12.50)5(31.25)0.0090.925巨结肠类型[n(%)]短段型常见型长段+全结肠16(69.57)20(71.43)10(66.67)7(30.43)8(28.57)5(33.33)0.1050.949术前BMI[kg/m2,(x±s)]16.10±2.0516.32±2.100.3620.719WBC[×109/L,(x±s)]10.66±3.1511.28±3.200.7310.467RBC[×1012/L,(x±s)]4.68±0.804.86±0.880.8150.418HGB[g/L,(x±s)]110.96±26.50112.45±30.330.2010.841ALB[g/L,(x±s)]42.80±10.0843.66±11.040.3100.758GLO[g/L,(x±s)]22.04±5.6020.10±5.141.3240.190PA[mg/L,(x±s)]166.28±40.10180.30±50.701.2030.233TNF-α[pg/mL,(x±s)]39.06±10.3347.60±11.023.0250.004IL-6[pg/mL,(x±s)]28.40±7.6636.05±8.463.6130.001IL-8[pg/mL,(x±s)]16.20±4.0223.06±6.555.217<0.001miR-223相对表达量(x±s)3.16±0.754.25±0.805.318<0.001

三、HD患者术后发生HAEC的多因素Logistic回归分析

将以上单因素分析中有统计学意义的因素(对于连续变量数据，以中位数取临界点转换成二分类资料)纳入二元Logistic多因素回归分析。结果显示，HD患者术前高表达的血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8均是术后发生HAEC的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

四、HD患者术前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8预测术后HAEC的ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，HD患者术前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8预测术后HAEC的ROC曲线下面积分别为0.889、0.826、0.678、0.657,详见图1和表5。

表4 HD患者术后发生HAEC的多因素二元Logistic回归分析Table 4 Multivariate logistic regression analysis of HAEC in HD children变量β值Wald χ2值P值OR值(95%CI)TNF-α>43.20(pg/mL)0.8396.6070.0102.314(1.806,7.366)IL-6>32.20(pg/mL)0.67014.805<0.0012.007(1.605,6.714)IL-8>20.10(pg/mL)0.6827.8130.0051.978(1.220,6.660)miR-223相对表达量>3.651.6317.0040.0085.110(3.402,10.644)

表5 HD患者术前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8预测术后HAEC的ROC曲线分析Table 5 ROC curve analysis of predicting postoperative HAEC with preoperative levels of mir-223,TNF-α,IL-6 and IL-8 in HD children变量曲线下面积截断值灵敏度(%)特异度(%)P值曲线下面积95%CI下限上限miR-223相对表达量0.8893.9086.7080.00<0.0010.7950.983IL-6(pg/mL)0.82645.1583.3075.00<0.0010.7050.947TNF-α(pg/mL)0.67834.2060.0075.000.0350.5240.831IL-8(pg/mL)0.65721.6060.0080.000.0430.4980.815

图1 HD患者术前血清miR-223、TNF-α、IL-6、IL-8预测术后HAEC的ROC曲线

讨 论

HAEC是HD手术的主要并发症。自Harald于1886年首次向柏林国际儿童疾病大会提交了2例HAEC患者病例资料后，各国医学专家学者都致力于对HAEC进行病因学、病理学、遗传学等的相关研究[7]。目前认为可能与肠管机械性扩张、肠道防御屏障异常、肠道感染以及基因表达异常有关[8,9]。其中，正常的肠道防御屏障可阻止病原微生物跨结肠上皮侵入，减少细菌感染，而肠道防御功能异常则会引发相关疾病[10,11]。TNF-α、IL-6和IL-8 均由炎症反应激活的炎症细胞合成分泌，具有促炎作用，均属于常见的炎症反应标志物。胡星等[12]研究表明，先天性巨结肠相关性小肠结肠炎患者血清TNF-α、IL-6和IL-8 均高于正常人群，且与HAEC评分呈正相关，提示炎症反应在HD相关性HAEC的发生发展中发挥重要作用，炎症系统被激活进而使炎症反应加速，炎症反应因子水平升高，最终引发HAEC。该研究认为TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子在HD相关性HAEC病情评估中具有较高的临床价值。同时，本研究结果显示，HD患者术前血清TNF-α、IL-6、IL-8均高于健康组，HD术后HAEC患者术前血清TNF-α、IL-6、IL-8均高于非HAEC组，提示HD患者术前血清TNF-α、IL-6、IL-8呈高表达，与术后HAEC密切相关，本研究结果与上述研究结果相似。进一步多因素Logistic分析发现，HD患者术前血清TNF-α、IL-6、IL-8高水平是引发术后HAEC的独立危险因素。因此，临床可根据HD患者术前的炎症因子水平给予对应的干预措施，可减少术后HAEC的风险。

作为本世纪生命科学领域的一个重大发现，miRNA被发现在疾病的发生发展和生物进化等生命活动中发挥着重要的调控作用。miR-223作为一种重要的miRNA，多项实验表明，miR-223对脂质代谢、炎症和癌变等都具有重要意义[13]。近年来，人们逐渐认识到miR-223作为靶向调控因子在多种疾病的诊断和预测中起到重要作用。有研究表示，miR-223在肠黏膜炎症反应、先天免疫、肿瘤生成等方面均发挥着重要作用，miR-223可通过多种途径对肠道炎症或者免疫反应进行调节，进而影响多种肠道生理及病理过程[14-16]。杨丽等[17]研究发现，miR-223在坏死性小肠结肠炎患者中显著上调。经生物学分析发现，CLDN8、FOXO3a、NLRP8、ICAM1等主要的miR-223的靶基因可通过PPAR、MAPK等多种信号通路参与肠道屏障系统组成以及肠道炎症和免疫调节等过程，在相关肠道疾病的发生发展中起重要作用。其中，CLDN8是组成肠道屏障的重要部分，当肠道感染时，miR-223显著上调，促进炎症反应，同时抑制靶基因CLDN8的表达，并激活IL-23/T17细胞通路，进而破坏肠道屏障功能，进一步加剧肠道炎症[5]。因此，推测miR-223对HD患者术后HAEC可能有重要的调控作用。本研究结果显示，HD患者术前miR-223高于健康组，HD术后HAEC患者术前miR-223高于非HAEC组，提示HD患者术前miR-223呈高表达，与术后HAEC密切相关，这与上述研究结果一致。但是，在Neudecker等[18]对小鼠的实验中，肠炎样本miR-223相对表达量升高，而高表达的miR-223可通过抑制NLRP3炎性体及IL-8从而减轻实验性肠炎。这与本研究结果存在一定差异，可能与研究对象和实验方法不同有关，因此需对此领域进一步研究。进一步多因素Logistic分析发现，HD患者术前miR-223高表达是引发术后HAEC的独立危险因素。因此，积极对HD患者术前进行miR-223的检测，可及时作出有效的预防措施，减少术后HAEC的发生。

ROC曲线分析结果显示，HD患者术前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8预测术后HAEC的ROC曲线下面积分别为0.889、0.826、0.678、0.657，对应截断值分别为3.90 pg/mL(灵敏度=86.70%，特异度=80.00%)、34.20 pg/mL(灵敏度=83.30%，特异度=75.00%)、45.15 pg/mL(灵敏度=60.00%，特异度=75.00%)、21.60 pg/mL(灵敏度=60.00%，特异度=80.00%)。可见，HD患者术前miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8对术后HAEC均有较高的预测效能，临床可通过对术前相关指标的检测，来进行术后HAEC的风险评估，及时采取干预方案，提高HD患者生存质量。由于本研究存在样本量较小、观察时间较短等不足，结果可能会存在一定偏倚，因此仍需更深入的研究予以进一步证实。

综上所述，先天性巨结肠患者术前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8高表达，且是术后发生HAEC的独立危险因素；同时术前血清miR-223、IL-6、TNF-α、IL-8对术后HAEC的发生具有较高的预测价值，临床可通过对术前相关指标的检测，来进行术后HAEC的风险评估，以及时作出干预，提高患者生存质量。