化妆品微生物污染检测技术及应对策略

隆婷 李晶 王梓烟 林婕 王亚婷

通过对化妆品微生物污染现状的阐述，以及对菌落总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌的检测技术从常规方法和新技术两方面进行归纳总结，探讨了新技术的发展方向;同时提出了减少化妆品微生物污染的应对策略：针对微生物污染的来源，从产品生产过程和日常使用过程进行控制;产品配方中加入适量的防腐剂，构建良好的防腐体系，抑制微生物的生长与繁殖。

对化妆品微生物检测的要求不仅要快速而且要准确，可以应用一些化妆品微生物快速检测技术，例如ATP生物荧光增幅法、Petrifilm菌落总数测试方法、多重PCR技术等。减少化妆品微生物污染的研究：加强预防化妆品污染措施和微生物检验能力的研究以及完善化妆品微生物阳关法规;加强防腐剂对于微生物的抑菌l作用效果以及含抗菌剂化妆品的抗菌作用研究。

化妆品是指以涂擦、喷洒或者其他类似方法，施用于皮肤、毛发、指甲、口唇等人体表面，以清洁、保护、美化、修饰为目的的日用化学工业产品。[1]。随着人们生活水平的逐步提高，化妆品已基本成为生活必需品，而大部分化妆品（尤其是护肤品）含有比较丰富的营养成分，如植物蛋白、海藻提取物、动物蛋白等，可成为多种微生物生长、繁殖的良好培养基[2-3]，造成微生物污染。2017年，某医学院校研究得出，化妆品中滋生的致病微生物主要有粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及霉菌和酵母菌。粪大肠菌群是人体肠道和体表重要的正常菌群，当人体免疫力低下时，可诱发胃肠炎和各种肠道外感染，严重者可致败血症。而金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对各种理化因素均具有较强的抵抗力，并且近年来临床耐药现象严重，可引起感染，导致各种器官化脓性炎症甚至菌血症和败血症[4]。霉菌毒素很多对人体有强烈的致癌作用，也可以引起腹泻、呕吐等症状。真菌污染，是诱发皮肤疾病和过敏反应性疾病的关键因素，尤其是对免疫功能低下及过敏性体质者危害更为突出。当今社会化妆品微生物污染的状况越发受到重视，所以对于其检测技术的总结以及应对策略的探讨等方面是值得关注的。

化妆品微生物污染现状

微生物污染来源

一般化妆品的微生物污染途径包括一次污染和二次污染[5]。一次污染指化妆品生产过程中引起的微生物污染，包括原料、仪器、设备、生产、包装过程及储存条件等引起的微生物污染。化妆品中的成分，多半属于富合营养的有机物质，原料污染是一次污染的最大原因。人体在正常状态下带有无数微生物，这些微生物可以从生产人员体表带到产品中，还有仪器设备清洗、消毒不完全或是未能按相关储存要求储存，通风不畅、潮湿的环境以及内容物密封不严等，也会导致产品的污染与变质[6]。

二次污染主要是指化妆品使用过程中产生的污染，包括手部接触化妆品后将微生物带入，或空气中的微生物落入使化妆品被污染。近年来，有很多探讨影响化妆品二次污染因素的研究，可得出化妆品的种类、剂型、包装方式、使用日期、保存方法以及个人卫生习惯均可能引起化妆品二次污染[7-11]。

微生物污染现状

化妆品微生物污染的常见污染菌包括国标中提到的粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。从2011年张丹、闵红对市场中化妆品进行随机抽检[12]到2020年曹婷婷、江艳芳等对508批化妆品进行微生物检验的研究[13]，可看出未开封化妆品的合格率总体都在90%以上且没有明显的变化趋势。近几年，关于化妆品二次污染检测的研究较多[14-16]，研究结果显示已使用过的化妆品的合格率低于未开封化妆品，且使用时间越长受污染程度越高。

就真菌而言，由于其具有分布范围广、易传播等特点，易使化妆品受到污染。目前有关于化妆品真菌污染的研究一直在进行和发展中，然而多限于对真菌数量的测定，而缺乏对致病种类的关注。

2013年，李萌等对受污染面膜进行了菌株分离培养，通过形态观察并结合分子生物学手段，对其中真菌的种类进行了精细分类，分离到的菌株有Scopu[ariopsis brevicaulis（短帚霉）、Penici[[ium chrysogenum（青霉菌）、A＼ternaria（链格孢霉）、Cladosporium cladosporioides（枝状枝孢霉），明确了化妆品易污染真菌的种类。上述这些真菌的污染，对化妆品的质量和使用者的身体健康情况会造成巨大威胁[17]。

评估化妆品微生物污染除了检测常见污染菌外，其他的特殊污染菌也有着重要的检测意义。

韶关学院医学院的几个学生选取了2015年6月至2016年5月韶关学院医学院在校大学生使用的化妆品作为研究对象，随机抽取了139份在校大学生使用中的化妆品进行微生物卫生学检验，结果在抽取样品中共检出粪大肠菌群3株，金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌各2株，铜绿假单胞菌、变异库克菌、黏质沙雷菌和产碱菌属各1株[18]。

2020年江西省药品检验检测研究院、国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室等在化妆品样品中检出菌落总数超标，并经VITEK2COM PACT自动微生物快速检测分析系统鉴定出污染菌有豕链球菌（Streptococcusporcinus）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）、成团泛菌（Pantoea agg[omerans）[19]。豕链球菌为链球菌属，在肺炎病例中偶尔会检测出此菌，近年来，国外有报道该菌有可能是早產胎膜破裂和宫颈功能不全的发病机制[20];玫瑰色考克氏菌为革兰氏阴性球菌、考克氏菌属、耐辐射微生物，可作为化妆品质量评定的指标菌株;成团泛菌是革兰氏阴性的有氧芽孢杆菌，该病原菌的报道很少，国外有报道称其可能引起儿童脑膜炎及血液相关性疾病[21]。

化妆品微生物检测技术的探讨

《化妆品安全技术规范》（2015版）（以下简称“《规范》”）中明确规定，在进行样品前处理后，即针对菌落总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，霉菌和酵母菌这五个微生物检测指标进行相应的检测。

针对菌落总数，《规范》中规定的方法是常规的菌落计数方法，可操作性强，但步骤繁杂，准确度低。朱世真等人通过对14批化妆品人工添加3种常见试验菌，对《化妆品安全技术规范》和Petrifilm菌落总数测试方法进行比对。两种方法检测结果经t检验表明两种方法相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论表明：Petrifilm菌落总数测试片法因其轻便、快速、简易的优势在化妆品的微生物检测中具有重要意义[22]。

针对粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌三种致病菌，《規范》用到的是普通的增菌分离培养法，对可疑菌落进行生化鉴定。该方法需要配制各种培养基和试剂，操作繁琐，耗时4～7天，且存在对一些致病性金黄色葡萄球菌、粪大肠菌群检出率很低的问题，且三种致病菌没有实现同步检测，每种菌采用单独的实验方法进行检验。为了解决这些问题，化妆品微生物检测的发展也进入寻找更快速、检出率更高的新方法阶段。

翟磊[23]等人前期基于ATP生物荧光技术建立了一套适用于微生物快速检测的ATP生物荧光增幅法，具有检测速度快、准确度高的特点，可在48h内实现样品中细菌、霉菌和酵母菌的定性检验。但检测成本较高。

谢永强[24]等人将用于化妆品中BioLumix微生物荧光光电检测系统与《规范》微生物检测法进行了比较。结果显示两种方法的结果基本一致，但检测时效性有明显差异。《规范》微生物检测法检测化妆品并出具可靠的检测报告需要5天，而BioLumix系统检测化妆品细菌项目和霉菌、酵母项目可在16h和35h内分别发出预警，并可在48h内完整地输出检测报告。BioLumix系统检测速度快，但同样是检测成本高，需要配备BioLumix微生物荧光光电检测仪器。

杨秀茳[25]等人利用多重PCR技术建立快速检测化妆品中三种致病菌的方法。根据已报道的大肠杆菌phoA基因、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因oprL和金黄色葡萄球菌特异性序列Smal选择特异性引物，对人工染菌化妆品进行多重PCR检测。结果显示，三种致病菌的基因组DNA均可与各自引物特异性结合，扩增产物大小分别为622bp、504bp和426bp。该方法用于人工污染的化妆品中，大肠杆菌的检出限浓度为103CFU/mL，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检出限浓度为105CFU/mL。其建立的多重PCR方法可同时快速、特异地对化妆品中三种致病菌进行检测，在化妆品行业具有较大的应用价值。但该方法操作较常规方法成本高。

不难发现，新的技术聚焦于实现多个检验指标的同步检测，在快速检验的同时达到较高的检出率和准确度。

这三种常见的致病菌的新的检测方法也在不断被探索，经过不断发展将可应用于化妆品微生物高通量检验。

如目前在金黄色葡萄球菌快速检测方面迅速发展的免疫磁珠技术。周莉[26]等人利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体进行分离富集，将这一技术应用于食品中的金黄色葡萄球菌检测。将这一分离富集技术与其他快检方法结合可大大提高检测的灵敏度等各项指标。如：免疫磁珠一多重聚合酶链式反应[27]、免疫磁珠富集-PCR法[28]、免疫磁珠一环介导等温扩增技术[29]、免疫磁珠-ATP发光检测[30]技术。这些方法目前都在食源性病原微生物检测及医学诊断领域得到快速发展，将这一技术与恰当的样品前处理方法结合应用于化妆品微生物检验方面将建立一种快速高灵敏度的方法。

对于化妆品中常见的污染菌铜绿假单胞菌，不同的铜绿假单胞菌菌株中发现的完整基因组包括10000 - 40000个基因，菌株之间的基因组排列可能有所不同，难以鉴定适合基因标记的区域。因此，该菌的代谢组学是研究重点[31]，新的研究聚焦于找出除绿脓菌素外其他的代谢物。对于常见的大肠杆菌的检测，新的方法主要以与光电分析技术结合为着手点，如：王毅梦[32]等提出的基于碳纳米管修饰的DNA电化学传感器用于大肠杆菌基因片段检测。

而针对霉菌和酵母菌这一检验指标，《规范》规定的常规培养检测周期长、检出率低，今后的发展更趋向于采用分子学技术。李萌[17]等提出的基于ITS序列的化妆品中污染真菌检测与鉴定，该方法克服了常规方法的问题，在分子水平上进行真菌检测，但成本较高，可操作性不强。

化妆品微生物污染的应对策略

在化妆品的日常使用过程中，微生物污染也是不可避免的。对于微生物污染的控制，主要是加强对企业的监管，一方面是针对微生物污染的来源，从产品生产过程和日常使用过程进行控制;另一方面，是在产品配方中加入适量的防腐剂，在产品内部构建一个良好的防腐体系，抑制微生物的生长与繁殖。

产品生产过程中的监控

防止原料的污染

化妆品原料种类繁多，原料的质量在很大程度上决定成品的质量，所以，在化妆品的生产过程中必须建立原材料的检测程序，制定原料的微生物检测指标，采用严格的杀菌、除菌方法。原料贮存时容易污染，应采用防潮容器，按规定的温度保存，在保质期内使用。化妆品用水一般采用去离子水或蒸馏水，贮存几天后会产生各种杂菌。为保证用水的质量，应每日检测水中的微生物，保证微生物不超标。

防止环境和设备的污染

严格规定生产环境中空气系统，包括进入空气的质量、温度、湿度、交换速度和系统设计对空气纯度的要求，并且要考虑进、出通风口的位置，以及控制气流模式的管道的布置。在潮湿地区，需定期对墙壁、天花板、地板、锅釜、搅拌浆、供料管和用具进行强力清洗和杀菌消毒。

防止成品包装污染

成品包装材料（桶、瓶、盖）的不卫生会造成化妆品的微生物污染，需要清洗后再投入使用。最常见的包装包括玻璃瓶、塑料瓶、复合塑料袋、塑料软管等。而纸盒常用作中、高档化妆品的外包装。中、低价位的护肤品大多使用复合塑料袋、塑料软管和塑料瓶;而高档产品更为青睐玻璃瓶，特别是香水包装，绝大多数都使用的是玻璃容器。提高各类成品包装的卫生洁净程度是保持化妆品质量的措施之一。

防止操作人员的污染

人的皮肤、鼻、耳、口等均有微生物存在，良好的个人卫生是控制微生物污染的有效方法，不执行良好个人卫生的员工将使以上所述的所有工作失去效果，操作人员应穿戴清洁专用的卫生服、卫生帽、卫生鞋，同时生产人员的手应进行消毒。

关于应用防腐剂

1.采取复合型防腐剂。与单一防腐剂相比，其优点主要包括拓宽抑菌谱、提高抑菌活性、延长使用期限。复合型防腐剂既能保证化妆品质量的安全，又能防止使用过程中的再污染。

2.应采用安全度较高的防腐剂。使用低毒、无毒和无刺激的防腐剂，例如采用新兴的天然防腐剂，其主要是从动植物或微生物中提取。

3.开发具有功能性的新型防腐剂。化妆品的防腐剂应加强其防腐作用，也可以有抗衰老、美白及祛痘等其他功效，对皮肤问题有针对性，如植物提取物，从甘草中提取的甘草酸除了具有抑菌效果外，还具有抗氧化、美白和消炎等功效作用[33];丁香酚也具有抑菌、消炎和抗氧化等作用效果[34]。

减少二次污染的策略

1.在购买化妆品前，不但要注意其生产日期和使用期限，同时也要关注其种类、包装方式和价格。不能因美观的包装或者低廉的价格，而忽略了质量;否则，选择的化妆品很可能引发相关的微生物污染，导致皮肤或身体受到危害。

2.在化妆品使用过程中更应该关注其微生物的污染状况。要时常检查使用期限，避免超期过长，一旦发现过期，就应该停止使用及时更换;在使用前可以做小部位的使用，避免微生物污染严重导致对身体产生危害，若发现不适，及时停止使用。

3.开封后的化妆品应该妥善保存。研究数据显示，在非避光条件下保存的化妆品污染较重，在潮湿环境下保存的化妆品污染更严重，所以我们应该将化妆品置于非避光且干燥的地方保存，减少微生物的污染。

结论与展望

随着经济发展，化妆品成为人们日常生活的必需品，其微生物污染也成为社会关注的重点问题。污染的微生物可能存在致病性或条件致病性微生物，而这些污染微生物传播的方式主要包括二次污染中消费者使用不洁净的手涂抹、不洁净的化妆品用具、容器敞开、包装设计不科学等。污染微生物产生的某些代谢产物，可刺激皮肤发生炎症或过敏反应，对人体造成的危害会产生不可估量的风险，因此，规范对化妆品质量的有效监督和管理十分重要。目前，化妆品微生物的检测技术正朝着快速、简便、准确的方向发展，主要方法包括ATP生物荧光增幅法、Petrifi[m菌落总数测试方法、多重PCR技术等。化妆品质量控制的发展趋势是在化妆品微生物检验能力上不断加强，且化妆品微生物检测法规也将更加完善。为了让消费者能更加放心地使用化妆品，采用抗菌作用廣、低刺激、温和型防腐剂以及含抗菌性化妆品已成为当前社会化妆品研发的热点。[作者来自南华大学公共卫生学院。基金项目：国家级大学生创新创业训练项目（201910555050）]

参考文献

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.化妆品标识管理规定[s]北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2007

[2]韩信，谢小钰，袁辰刚，等.进出口化妆品的卫生状况及微生物种群分析[J]香料香精化妆品2013 （3）37-42

[3]周龙霞.市售化妆品微生物污染状况调查[J]世界最新医学信息文摘，2016，16（45）：221

[4]李凡，徐志凯.医学微生物学[M]8版北京：人民卫生出版社，2014：91-169

[5]张朝武.卫生微生物[M]3版北京：人民卫生出版社，2005：176-185

[6]胡梅.化妆品防腐及防腐体系的构建[A]中国香料香精化妆品工业协会第九届中国化妆品学术研讨会论文集（下）[C].中国香料香精化妆品工业协会：中国香料香精化妆品工业协会.2012：

[7]李海芳，古丽巴哈尔·托乎提，张明君，等.2016年2018年新疆化妆品微生物检验结果分析[J]中国卫生检验杂志，2020，30（08）：937-940

[8]朱紫杭，周焕宁，卢嘉明.化妆品微生物二次污染研究[J]海峡预防医学杂志，2006（02）：50-51

[9]张红.关于化妆品微生物检验中若干改进的探讨[J]临床医药文献电子杂志，2015.2（18）：3816+3818

[10]高扬帆，关云凤，高晗，等.女大学生补水类化妆品中的细菌污染的主要因素[J]中国民康医学，2015，27（07）：110-111+116

[11]刘伟伟，罗岩.化妆品微生物的检测分析[J]化工管理，2018（11）：101.

[12]张丹，闵红.化妆品微生物污染检测[J]医学动物防制，2011（10）：949950

[13]曹婷婷，江艳芳，林铁豪.508批化妆品微生物检验结果及方法的初步研

究[J]香料香精化妆品，2020（06）：29-32

[14]郝玉娥，陈旭，何爱桃，等.日常化妆品中微生物的检测分析[D]，2011

[15]高尚.关于日常化妆品中微生物污染的检测分析[D]，2013

[16]王红，孙腾，关云凤，等.女大学生补水类化妆品中的细菌污染状况研究[J]牡丹江医学院学报，2015，36（1）：83-84

[17]李萌，高路，何聪芬，等.基于ITS序列的化妆品中污染真菌检测与鉴定[J]中国卫生检验杂志，2013，23（15）：3057-3059+3064

[18]田树钊，宾羽琳，王萌，等.某医学院校大学生使用护肤类化妆品的微生物污染情况及其影响因素[J]现代医药卫生，2017，33（23）：3552-3556

[19]张静，刘绪平，易路遥，等.化妆品微生物污染状况及其防腐剂使用情况分析[J]日用化学工业，2020，50（10）：698-703+710