在微球透镜辅助下的成像研究

张剑边填轩李辉张炆涛李萌萱

(山东建筑大学 理学院，山东 济南250101)

0 引言

光学显微镜是由不同焦距的透镜组合而成的一种光学系统，丰富了人们对于微观世界的认识，在生产、生活、科研和医疗等领域应用非常广泛。 分辨率和放大率是衡量显微镜性能的重要参数，主要取决于透镜的焦距。 光学显微镜的极限放大率为1 600 倍，在使用油浸介质的情况下达到2 000 倍，极限分辨率则可达200 nm[1]。 由于高质量的光学显微镜的价格昂贵，因此利用低倍显微镜实现高分辨率和超分辨可以大大降低使用成本。

CHEN 等[2]提出了纳米光子喷流的概念，用时域有限差分法计算了当平面光束经过介电圆柱时的衍射图像，圆柱的另一侧阴影区域出现了束腰小于波长的光斑，强度为入射光强的150 倍，传播大约两个波长的距离时光斑没有明显的衍射，当电介质圆柱折射率变小时，光斑从圆柱内逐渐移动到圆柱表面外侧。 纳米光子喷流已应用于光学超显微[3-4]、微粒操控[5-6]、辅助共聚焦显微[7]，还可以实现增强拉曼散射和增强荧光显微[8]。 科研人员通过改变环境介质折射率[9]和介观尺寸电介质材料的结构降低纳米光子喷流的半峰宽，增加发射长度和改变光束扭曲程度。 已经证明的结构有串联微结构[10]、透明介质微球埋入透明介质立方体结构[11]、蜘蛛丝形成的纺锤结构[12]、双层透明介质微圆柱[13]、双透明介质微半圆柱[14]等，此外双纳米光子喷流也已得到证明[15]。

在光学超显微领域，主要讨论了尺寸＜50 μm的透明介质微球放在样品表面提高显微镜分辨率的作用，微球到样品的距离和在样品上的位置都很难控制。 研究人员认为纳米光子喷流越长，改变微球到样品的距离时，能够得到清晰放大图像的位置就越多[16]。 文章研究了尺寸＞200 μm 透明介质微球，其相当于短焦距的透镜，使用光学平移台和细金属丝可以方便地改变其位置且操作方便。 应用几何光学可以计算出焦点的位置，通过改变透明介质微球焦点和样品之间的距离，既可以成实像也可以成虚像，还可以调整放大率。 透明介质微球体积小，几十克的微球其数量可达到几千或者几万，单个介质微球的成本非常低，因此应用介质微球辅助低倍显微镜可提高分辨率和放大率，减少昂贵的高分辨显微镜的使用，大大降低了实验成本。

1 理论分析

波动光学和几何光学都可以用来计算透明介质微球的纳米光子喷流位置。 当球的尺寸与波长相当时可用波动光学，而当微球的尺寸远大于波长时则可用几何光学。 一般认为尺寸＞50 μm 的微球的焦点位置的计算可以采用几何光学。 在傍轴光线条件下，透明介质微球可以看作是厚透镜，应用两次球面物象折射公式，可以计算出焦点位置。 透明介质微球焦点计算原理如图1 所示。P为物点，P′、P″分别为经过第一、第二个球面成像的像点。n1和n2分别为透明介质微球左、右两边的介质折射率，n为介质球的折射率，O和O′分别为左、右球面的中心，S、S″分别为经过第一、二个球面成像的物距和像距，S′和S′ -2r为第一、二个球面成像的像距和物距，r为球面半径。

根据球面物像折射公式[1]，透明微球的成像规律由式(1)和(2)表示为

当平行光入射时，S ＝∞，因此像距由式(3)～(5)表示为式中f ′为焦点到O′的距离。

当n1＝n2时，f ′由式(6)表示为

当n1＝n2＝1 时，焦点到球心的距离由式(7)表示为

焦点到微球球面距离与微球半径比值随折射率的变化曲线如图2 所示。 焦点到球面的距离随着折射率的升高而减小，焦点光斑的半角宽度增加，从而显微数值孔径增加，这是透明介质微球能够提高分辨率的原因之一。 当折射率为2 时，焦点落在透明介质微球表面；当折射率＞2 时，焦点进入透明介质微球内部。

图2 焦点到微球球面距离与微球半径比值随折射率的变化曲线图

透明介质微球的放大率由物距和焦点的位置决定。 成虚像时，放大率由式(8)表示为

式中m为放大率；u为物距。n增加时，f减小，物距不变时，放大率减小；n不变时，物距增加，放大率增加。

成实像时，放大率由式(9)表示为

2 实验设备与材料

采用低倍光学显微镜，其目镜为10 倍，而物镜分别为4、10、40 倍，光源采用商用发光二极管(Light Emitting Diode，LED)白光光源。 用胶水将透明介质微球固定在细铜丝的一端，另一端固定于螺旋测微器，调整螺旋测微器可以改变透明介质微球到样品的距离，距离的精度为10 μm。 用螺旋测微器测量盖玻片的厚度为170 μm。 样品有植物根尖永久装片、洋葱细胞永久装片和临时装片。 实验采用硅胶、玻璃和钛酸钡等3 种材料的透明介质微球，折射率分别为1.46、1.50 和1.90。 二氧化硅微球的直径为600～1 000 μm、玻璃微球的直径为1 000 μm、钛酸钡微球的直径约为200 μm。 透明介质微球成像分为:(1)S＜f，成放大的虚像；(2)f＜S＜2f，成放大的实像；(3) 玻璃微球和硅胶微球对比；(4) 透明介质微球焦点直径的测量；(5)光学超分辨。透明介质微球显微原理如图3 所示。

图3 透明介质微球显微原理图

3 实验结果分析

3.1 微球辅助成放大虚像

采用自制洋葱表皮细胞装片作为显微样品，样品放置在盖玻片上。 显微图像如图4 所示，in为归一化图像强度，图像显示采用log-log 方式，图像矩阵均为150 pixel×150 pixel。 10×4 倍(目镜放大倍数×物镜放大倍数)时样品显微原图如图4(a)所示，细胞壁和细胞核都清晰可见。 显微镜10×4 倍下加入透明硅胶微球，并且微球与样品接触，因此物距为球的半径，显微图像如图4(b)所示，由于S＜f，因此成放大的虚像。 图4(c)为显微镜10×4 倍下加入透明硅胶微球的显微图像，调整螺旋测微器增加透明硅胶微球和样品间的距离，使虚像放大倍率最高，加入透明硅胶微球后分辨率和放大率明显提高。图4(b)和(c)中的虚线正方形表示细胞相同的位置，虚线正方形边长的像素数分别为12、60 个，说明放大率提高到原来的5 倍。 图4(d)为10×40 倍显微原图，根据细胞壁厚度可以判断图4(c)和(d)的放大率相当，所以图4(c)的放大率约为400 倍，是没有透明硅胶微球显微原图放大率的10 倍。 4 张图的图像强度最大值分别为5.5、4.8、4.2 和90，说明透明硅胶微球对光线有衰减作用。 微球和样品距离增加时图像强度也减小，这是由于光通量降低了，400 倍显微原图中物镜距离样品最近，通光量也就最大。

图4 洋葱细胞装片的显微图像(虚像)

3.2 微球辅助成放大实像

3.2.1 微球辅助放大实像的放大率

采用的透明硅胶微球直径为860 μm，由式(8)得其焦距f为682 μm，样品采用根尖细胞永久装片。 调整增加透明硅胶微球和样品距离，为了保证距离的准确，在样品和透明介质微球中间放入3 片盖玻片，永久装片上封装样品还有一片盖玻片，其厚度为170 μm，所以物距(样品到微球中心距离)为1 110 μm(4 个盖玻片厚度加微球半径)。 在1 倍焦距(682 μm)和2 倍焦距(1 364 μm)之间，成放大的实像。 根尖细胞永久装片显微镜原图如图5 所示，其中10×10 倍显微镜原图如图5(a)所示，放入透明硅胶微球的显微图如图5(b)所示。 在两图中根尖细胞相同的位置做线扫描，像素个数分别为17、47，图像放大了2.8 倍。

图5 根尖细胞永久装片显微图像

3.2.2 微球辅助放大实像的分辨率

采用透明硅胶微球的直径为630 μm，由式(8)得其焦距f为500 μm，样品为洋葱细胞永久装片。在透明介质微球和样品之间放入3 个盖玻片，加上样品自带的盖玻片，物距为995 μm。 在1 倍焦距(500 μm)和2 倍焦距(1 000 μm)之间，成放大的实像。 图6(a)为10×10 倍的洋葱细胞显微原图，图6(c)为放入透明硅胶微球后的显微图像，在细胞核的对应位置做线扫描(图中虚线所示)，线扫描的图像强度分别如图6(b)和(d)所示，分别有5 和6 个峰值。 图6(d)提供了更多的信息，图6(b)中第5个峰值的半峰宽为15 个像素，图6(d)中第5 和6个峰值的半峰宽为5 个像素，因此有硅胶透明介质微球时，图像分辨率提高了3 倍。 但是有透明硅胶微球时图像强度有所降低，这使得图像的衬度降低，并且由于透明硅胶微球的聚焦作用，图像强度成高斯分布，在图像中形成了明显的亮斑，也降低了图像衬度。

图6 洋葱细胞永久装片显微图像和对应位置图像强度

3.3 玻璃微球和硅胶微球对比

玻璃和硅胶的折射率分别为1.50、1.46。 根据折射率的大小，玻璃微球的分辨率应该大于硅胶微球的分辨率。 玻璃微球和硅胶微球的显微图像如图7 所示。 可以看出，图7(b)显示了更多的信息，箭头所示位置的颗粒更加清晰，而图7(a)图像模糊。这说明微球的质量，像平整程度、内部缺陷等因素也会影响图像的质量。

3.4 焦点直径测量结果

几何光学认为光的波长为零，在均匀介质中沿着直线传播，当光线经过两种介质的分界面时会发生折射和反射，并改变其偏振面。 由于忽略了衍射效应，所以平行光经过透明介质微球全部汇聚在一点上。 因此，利用几何光学方法计算焦点的位置，只能给出焦点到球面的距离，而无法给出焦点光斑的尺寸。 焦点光斑直径决定了透明介质微球成像的分辨率。 进一步用实验测量焦点光斑尺寸测量[17-18]，显微镜的像素分辨率与焦点光斑直径的像素数相乘就得到焦点光斑的大小。

测量透明介质微球焦点直径的光路如图8 所示。 30 mW 的532 nm 绿色激光首先通过中性衰减片，光强衰减，避免显微镜互补金属氧化物半导体(Complementary Metal Oxide Semiconductor，CMOS)相机饱和，然后光束经过直角反光镜射向透明介质微球，透明介质微球放在盖玻片上，近似认为盖玻片对激光束波前没有影响，衍射光束进入光学显微镜，显微镜放大率为10×4 倍，CMOS 相机记录衍射光束。

上下移动显微镜物镜，进行连续拍摄，得到一组衍射光场的二维图像，用差值法组合成衍射光场的三维图像。 (1) 粗调显微镜物镜，找到透明介质微球的焦点；(2) 反复细调，中心光斑最小的一张显示焦点光斑的大小。

图7 根尖细胞显微图像

图8 测量透明介质微球焦点直径光路图

为了标定聚焦条件下CMOS 相机单个像素的分辨率，先测量铜丝的直径。 金属丝的硬度较大，在螺旋测微器夹持下不易发生形变，不影响测量的准确性，而透明介质微球在螺旋测微器夹持下变形严重，无法用来标定显微镜。 在铜丝的10 个不同位置用螺旋测微器测量其直径，聚焦条件拍摄铜丝的显微图像，利用MATLAB 软件对铜丝显微图像进行显示，如图9 所示。 10 个位置测量的铜丝直径和像素数结果见表1，其平均直径为0.156 mm，铜丝长度平均像素个数为111.5 个，两者相除得到CMOS 相机每个像素的分辨率为1.4 μm。

测量4 个透明介质微球的焦点直径，如图10 所示。其中，图10(a)硅胶介质微球1的直径大于图10(b)硅胶微球2 的直径。

4 个透明介质微球的焦点直径见表2。 对于透明硅胶球1 和2，球的直径减小，焦点的直径也减小；透明玻璃微球焦点最大，并且出现多个强度和大小接近的光斑，散焦严重，这是图7(a)比(b)模糊的原因。 透明钛酸钡微球焦点直径最小，并且聚焦效果良好。 4 个球中钛酸钡微球的分辨率最高。

图9 铜丝40 倍显微图像

表1 铜丝的直径和像素数表

图10 透明介质微球衍射图

表2 透明介质微球焦点直径表

3.5 钛酸钡微球辅助超分辨

样品为孔间距为125 nm 的双通多孔氧化铝(Anodic Aluminum Oxide，AAO)模板，电镜照片如图11(a)所示，虚线位置可以认为是AAO 模板的一个单元，由7 个直径为125 nm 的微孔组成。 显微镜放大率为10×4，采用直径为200 μm 的钛酸钡微球[19]。 将双通AAO 模板放在载玻片上，用光学平移台调整透明钛酸钡微球到AAO 模板的距离，使其与AAO 模板接触。 在双通AAO 模板与透明钛酸钡微球之间加入异丙醇，得到图11(a)中虚线位置的显微图像如图11(b)所示，分辨率达到了125 nm，小于光学显微镜的极限分辨率200 nm。

图11 双通AAO 模板电镜图和超分辨图像

4 结论

通过理论计算和实验结果分析，主要得到以下结论:

(1) 透明介质微球能够提高显微镜的放大率和分辨率，放大率由焦点和样品位置决定，分辨率由焦点光斑的位置和直径决定，而两者都和微球的大小和折射率有关；透明硅胶微球的显微图像的放大率可以是显微原图的10 倍。

(2) 约200 μm 的钛酸钡微球可以实现125 nm的超分辨，因为其直径较大，比几十μm 的透明介质微球操作方便，可以用来组成低价的超分辨系统；单个透明介质微球的成本较低，可以用来提高显微镜的放大率和分辨率，降低实验室成本。