口服三七总皂甙对大黄鱼免疫功能的影响

陈秀霞， 池洪树， 许斌福， 谢岸桦， 方冬兰， 龚 晖

(福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州 350003)

三七总皂甙(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)是植物三七的主要活性成分，含人参皂甙Rb1、Rg1和三七皂甙R1等多种单体皂甙[1]。PNS具改善心血管、抗纤维化、抗血栓、免疫调节等广泛的药理作用[2]。相关研究显示，PNS能显著增加小鼠免疫器官指数，提高小鼠血清溶血素的含量，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、转化作用，提高小鼠自然杀伤细胞活性[3-4]。饲料中添加适宜水平的PNS能显著提高异育银鲫和罗非鱼的非特异免疫功能[5-6]，但是否能提高鱼对病原的免疫保护力未知，且PNS对大黄鱼的口服免疫效果的研究尚未见报道。本文将添加不同剂量PNS的饲料投喂大黄鱼，检测肝、脾、头肾组织部分免疫相关基因的表达，以及血清部分免疫因子的活性，通过人工感染变形假单胞菌，以期了解口服PNS对大黄鱼的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

三七总皂甙(PNS)，购于南京泽朗医药生物科技有限公司，来源于五加科植物三七的干燥根，高效液相色谱法检测其纯度≥85%(Rb1 32.6%，Rg1 33.7%，R1 9.0%，Rd 7.9%，Re 4.4%)。将PNS粉末添加入粉状饲料(福建天马饲料有限公司)制作成浮性颗粒饲料。饲料添加PNS量分别为0、10、50、250 mg·kg-1，制备得4种不同PNS浓度(零浓度、低浓度、中浓度和高浓度)的实验饲料。

1.2 实验鱼及其分组

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)(平均体重约50 g)来自宁德富发水产有限公司。分4个组，按每组300尾分养于该公司位于三都澳鱼排上的4个网箱(2 m ×2 m × 4 m)，驯养一周后，各组分别投喂1.1节中所制备的饲料，连续投喂14 d，对照组，低浓度组，中浓度组和高浓度组的编号分别为0、1、2、3。试验期间水温为17～20 ℃，投饵率为鱼体质量的1%。

1.3 采样

投喂前采样：于投喂饵料前一天，每个网箱随机捞取3尾大黄鱼(4个网箱共计12尾鱼)，于浓度为100 mg·L-1的MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，SIGMA 公司)水溶液中浸浴。待大黄鱼失去知觉后，尾椎静脉采血，存放于冰盒；同时分别取肝、脾、头肾组织，立即存放于液氮。为减少个体差异造成的实验误差，每4尾鱼的同一组织混合成一个样品，每个组织3个样品(即3个生物学重复)。所采集的血样4 ℃静置过夜，经3 000 r·min-1离心5 min，收集上层血清。从中取3支血清量足、色泽正常、无溶血的样品用于后续部分免疫因子活性检测。

投喂后采样：投喂结束后的第2天，每个网箱(即每组)分别捞12尾大黄鱼，浸浴麻醉，尾椎静脉采血，取肝、脾、头肾组织。每4尾鱼所取的同一组织混合成一个样品，每组共3个样品(即3个生物学重复)。血清分离方法、选样检测方法同上。

1.4 人工感染实验

1.4.1 变形假单胞菌复苏、培养、计数

取变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)菌株H2017050402保种液划线接种于胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)平板上，28 ℃培养24 h。挑取TSA培养单菌落接种于10 mL胰酪大豆胨液体培养基(TSB)试管中，于20 ℃、转速150 r·min-1的摇床培养16 h。取过夜培养的菌液0.5 mL转接于50 mL TSB三角瓶中，20 ℃，150 r·min-1摇床培养16 h。同时将其余的9.5 mL菌液于6 000 r·min-1离心10 min，弃上清，沉淀加生理盐水重悬稀释，使得D595=0.5，以此作为母液，用生理盐水进行梯度稀释，分别取0.5 mL稀释液均匀平铺于TSA平板上，28 ℃恒温培养过夜后计数，将菌用生理盐水重悬成浓度为2×105CFU·mL-1的菌悬液。

1.4.2 攻毒

投喂结束后的第2天，各浓度组随机捞取100尾大黄鱼，分3个平行组，每组30～36尾，浸浴麻醉(方法同上)。根据预攻毒实验结果，每尾鱼腹腔注射菌悬液0.3 mL。各浓度组另外随机捞取22～25尾大黄鱼，每尾注射0.3 mL生理盐水。连续观察7 d，及时清理死鱼，记录死亡率。期间水温18～20 ℃。

1.5 血清部分免疫因子活性检测

采用南京建成生物工程研究所的测定试剂盒测定血清样品的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性。按试剂盒说明书进行操作。

1.6 组织部分免疫因子相对表达量分析

1.6.1 总RNA提取及cDNA合成

采用RNA提取试剂盒RNAiso Plus( TaKaRa )，提取大黄鱼肝、脾、头肾组织中的总RNA。用超微量分光光度仪测定抽提所得RNA浓度。按反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser( TaKaRa )说明反转录合成cDNA。

1.6.2 荧光定量PCR分析

使用Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System仪器进行荧光定量PCR检测大黄鱼肝、脾、头肾组织中粘病毒抗性蛋白(Mx)， 主要组织相容性复合体Ⅱ类α链(MHCⅡ-α)， 肿瘤坏死因子α链(TNF-α) 和 白细胞介素10(IL-10)的表达。内参基因β-actin与目的基因的引物序列见表1[7]。采用试剂盒TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ( TaKaRa )，反应体系(20 μL)：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，稀释3倍后的cDNA模板2 μL，灭菌水6 μL。每个样品均设3个重复。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；熔解曲线阶段包括 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min和95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量[8]。

1.7 统计分析

实验数据以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 7 对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，对有显著(P<0.05)差异的，采用Tukey法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 血清部分非特异免疫因子活性

如图1所示，低浓度组、中浓度组和高浓度组大黄鱼血清SOD、LZM、ACP和ALP活性均与对照组无显著差异(P≥0.05)。与对照组相比，口服不同浓度PNS的大黄鱼的LZM活性均略有提高，ACP活性略有下降。

表1 荧光定量PCR引物序列

2.2 组织部分免疫因子相对表达水平

总体而言，口服PNS 14 d后，各浓度组大黄鱼肝、脾和头肾组织的IL-10、MHCⅡ-α和TNF-α的相对表达水平与对照组差异不显著(P≥0.05)；高浓度组大黄鱼脾组织中Mx的相对表达水平显著(P<0.05)高于对照组。

如图2所示，在肝组织中，各浓度组Mx的相对表达水平均略高于对照组，TNF-α的相对表达水平均略低于对照组；中浓度组和高浓度组IL-10的表达水平略低于对照组；中浓度组MHCⅡ-α的相对表达水平略高于对照组，但低浓度组和高浓度组MHCⅡ-α的相对表达水平略高于对照组。

如图3所示，在脾组织中，低浓度组和中浓度组的IL-10的相对表达水平略低于对照组；低浓度组的MHCⅡ-α的相对表达水平略高于对照组；高浓度组的Mx表达水平显著(P<0.05)高于对照组，中浓度组的Mx表达水平略高于对照组；各浓度组TNF-α的相对表达水平均略低于对照组。

各柱状图上方无相同小写字母的表示各处理组间差异显著(P<0.05)。处理组0、1、2、3分别表示饲料中添加了0、10、50、250 mg·kg-1 PNS。下同。Different lowercase letters above the columns represent statistically significant (P<0.05) differences among treatments. The treatment group 0, 1, 2, 3 represented the treatment with diets containing 0, 10, 50, 250 mg·kg-1 PNS. The same as below.图1 大黄鱼血清部分非特异免疫因子活性Fig.1 Activities of serum nonspecific immune parameters of large yellow croaker

图2 大黄鱼肝组织部分免疫因子相对表达水平Fig.2 Relative expression levels of immune related factors in liver

图3 大黄鱼脾组织部分免疫因子相对表达水平Fig.3 Relative expression levels of immune related factors in spleen

图4 头肾组织部分免疫因子相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of immune related factors in head-kidney

如图4所示，在头肾组织中，各浓度组的IL-10和TNF-α的相对表达水平均略低于对照组；各浓度组的MHCⅡ-α的相对表达水平均略高于对照组；低浓度组的Mx表达水平略高于对照组。

图5 大黄鱼感染变形假单胞菌后每日死亡率Fig.5 Mortality per day of large yellow croaker challenged with Pseudomonas plecoglossicida

2.3 实验鱼感染变形假单胞菌后的死亡率

如图5所示，实验鱼感染变形假单胞菌后第3天出现死亡，死亡率集中在第4～6天，第4天死亡率最高，第5天次之。各组(0、1、2、3)第4天的死亡率分别为55.77%、47.0%、51.55%和45.0%，第5天的死亡率分别为25.96%、33.0%、36.08%和39.0%，各组之间死亡率分布差异不明显。各实验组的平均累计死亡率均大于95%，各组之间差异不显著(P≥0.05)。生理盐水注射组平均累计死亡率为1.45%。

3 讨论

PNS具有免疫佐剂活性和溶血性较低的特性[9]。研究表明，PNS能提高大鼠肺泡巨噬细胞及外周血中性粒细胞的吞噬率，提高大鼠特异性和非特异性细胞免疫功能[10]。PNS经由大孔树脂柱分离得到的流分PNS-5溶血性低，在体外能促进刀豆蛋白A (Con A)和脂多糖(LPS)诱导的脾淋巴细胞增殖反应，增强细胞免疫和体液免疫[11]。由此，本文对PNS是否适合作为大黄鱼的免疫调节剂进行了研究。

LZM、ACP、ALP和SOD是常见的鱼类非特异免疫和抗氧化因子。有报道表明，饲料中添加320和640 mg·kg-1PNS(纯度99%)连续投喂60 d能显著提高异育银鲫血清的LZM、ACP、ALP和SOD活力[5]。饲料中添加PNS连续60 d投喂罗非鱼的实验结果表明，100、200和400 mg·kg-1的PNS(纯度99%)能显著提高血清LZM活力，200和400 mg·kg-1的PNS显著提高血清ACP活力，800 mg·kg-1的PNS能显著提高ALP活力[6]。本实验中，PNS(纯度≥85%)连续投喂未能显著提高大黄鱼血清非特异免疫因子活性，可能与PNS添加剂量较低(10～250 mg·kg-1)以及投喂时间较短(14 d)有关，还需进一步研究。

TNF-α是一种主要由激活的单核/巨噬细胞分泌的炎性细胞因子。大量研究表明，三七总皂苷及其单体成分能抑制实验大鼠或小鼠TNF-α的表达，抑制炎症反应，表现其双向免疫调节作用[12-14]。此外，体外实验也表明，三七提取物能降低小鼠小胶质细胞炎症因子TNF-α和白细胞介素6(IL-6)的产生[15]。本实验结果显示，大黄鱼口服不同浓度PNS后肝、脾和头肾组织的TNF-α的相对表达水平虽与对照组差异不显著，但均低于对照组，这在一定程度上体现了PNS具有抑制炎症因子产生的作用。

此外，PNS还可能通过选择性调节某些细胞因子来实现免疫调节作用。例如，Hu等[16]用PCV2-AH预处理内皮细胞，再用5种不同的皂苷干预，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、IL-10和干扰素γ(IFN-γ)的表达，发现PNS能抑制IL-4和IL-10的产生，提高IL-2的表达。在前期研究中，我们将PNS体外作用于大黄鱼肾细胞的结果也显示，PNS对不同因子的影响作用不同，10～100 μg·mL-1的PNS对Toll样受体5 mRNA的表达有上调作用，对Toll样受体3 的表达有下调作用，对碱性磷酸酶和溶菌酶的表达无明显影响[17]。本实验中，大黄鱼口服PNS后各组织IL-10、Mx和MHCⅡ-α的相对表达水平不一致(Mx多数样品高于对照组，其中高浓度组脾组织中的Mx显著高于对照组；IL-10多数样品则低于对照组)，这可能与PNS对细胞因子的免疫调节具有选择性有关。

本文攻毒实验结果显示，PNS未能有效提高大黄鱼对变形假单胞菌的抵抗力。结合血清非特异免疫因子活性检测以及免疫相关因子定量PCR检测结果分析，推测有以下几点原因：(1)本实验PNS添加剂量和投喂时间不足；(2)可能与人工感染所用的假单胞菌特性有关，变形假单胞菌对大黄鱼的致病性受水温影响，攻毒实验期间水温(18～20 ℃)较预攻毒水温(22～24 ℃)低，该水温条件下变形假单胞菌毒力较强，导致各组死亡率偏高； (3)可能与不同的鱼种有关。尚未见有关PNS对其他鱼类免疫保护力的相关报道。

综上所述，本实验饲料中添加10～250 mg·kg-1的PNS连续14 d投喂大黄鱼未能取得良好的免疫效果，有必要改进PNS的给药方式，比较PNS对不同鱼种不同病原的免疫保护效果，同时对其免疫调节机理进行更深入的探讨。