潮汕地区3种中草药中10种有机磷农药残留分布特征及风险评估Δ

卢文杰，韩 飞，卢任杰

(1.汕头市中心医院门诊西药房，广东 汕头 515031； 2.汕头职业技术学院自然科学系，广东 汕头 515078； 3.汕头市食品检验检测中心检验室，广东 汕头 515041)

Δ基金项目：汕头市科技计划项目(汕府科〔2020〕5号文,No.12)

*主管药师。研究方向：医院药学。E-mail：jiep8@163.com

有机磷农药(organophosphorus pesticide, OPP)的使用有助于提高中草药的产量，但大部分OPP属于高毒性农药，过量使用会引起一些不良的后果，如残留药害、污染环境及人畜中毒等[1-3]。由于中草药中OPP残留引起的中毒现象尤为突出，严重威胁人类健康，因此，加强中草药中OPP残留分布特征及风险评估具有重要意义。但由于中草药本身含有糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸、挥发油、生物碱和苷类等复杂成分[4-5]，再加上OPP本身残留量较低，使得中草药中OPP的提取、分离、测定及残留分布特征分析难度较大[6-8]。

目前，多组分OPP残留检测方法主要有气相色谱法(gas chromatogram，GC)[9-10]、液相色谱法(liquid chromatography，LC)[11-12]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[13-15]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[16-17]及气相色谱-串联质谱法(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)[18-20]等。其中，GC-MS/MS具有灵敏度高、分析速度快、选择性好、高通量以及抗基质干扰强等优点，其多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式不仅解决了GC和LC易受杂质干扰、灵敏度低的问题，也有效消除了GC-MS选择离子扫描中存在的碎片离子信息少、定性不准等问题，且仪器价格低于LC-MS/MS，因此，GC-MS/MS已成为复杂基质样品中多组分OPP残留检测的理想技术。

QuEChERS法(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)利用吸附剂填料与基质中杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的，具有回收率高、准确度高、操作简便、溶剂消耗量少、分析速度快和安全可靠等优点[13-14]。为科学评估中草药中OPP残留量，本研究采用QuEChERS法处理潮汕地区常用中草药白花蛇舌草、茅根和臭花，以GC-MS/MS为分析检测手段，建立10种有机磷农药(敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷、三唑磷及联苯菊酯)的选择性多残留检测方法，以满足不同农药目标物、不同基质以及高选择性、高灵敏度的要求，并分析不同中草药中OPP总体残留水平、分布特征；结合《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)药材和饮片、GB 2763-2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》，对其OPP残留进行风险评估，为其风险控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

GCMS-TQ8040型气相色谱质谱/质谱联用仪(日本岛津公司)；气相色谱柱为SH-Rxi-5Sil-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱；AX124ZH型电子天平[奥豪斯国际贸易(上海)有限公司]；BUCHI R-200型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；LPD2500型多管漩涡混合仪(北京晨曦勇创科技有限公司)；HTC185型台式高速离心机(北京晨曦勇创科技有限公司)；SK3300H型高频台式超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

10种有机磷农药(敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷、三唑磷及联苯菊酯)标准品，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、乙酸乙酯、正己烷及丙酮，均为色谱纯，购自美国Fisher公司；吸附剂乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，购自美国Agilent公司；C18吸附剂、石墨化炭黑吸附剂(GCB)，购于上海安谱科学仪器有限公司；氯化钠、无水硫酸镁，均为分析纯，购自广州化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 溶液配制

(1)10种OPP标准储备液的配制：分别准确称取10种OPP标准品各0.2 g(精确至0.1 mg)，用乙酸乙酯溶解至100 ml容量瓶中并定容，配制成质量浓度为2 000 μg/ml。(2)10种OPP混合标准溶液的配制：分别准确移取适量10种OPP标准储备液，用乙酸乙酯稀释定容，配制成质量浓度为100 μg/ml。10种OPP化合物相关信息见表1。

表1 10种OPP化合物相关信息Tab 1 Information of 10 kinds of OPP compounds

2.2 GC-MS/MS条件

(1)气相条件：色谱柱为Rxi-5 Sil MS毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度为260 ℃；进样方式为不分流进样；载气He，流速为1.0 ml/min；进样量为1 μl；溶剂延迟时间为5 min。初始温度为40 ℃，保持4 min；以25 ℃/min 的速度升温至125 ℃，再以10 ℃/min 的速度升温至300 ℃，保持5 min。(2)质谱条件：电子轰击离子源(electron impact ion source，EI)；接口温度为280 ℃；离子源温度为200 ℃；检测方式为MRM；10种OPP化合物特征离子见表2。

2.3 样品前处理

将样品粉碎后过100目筛，装入棕色瓶中备用。称取粉碎成粉末的中草药样品2.0 g(精确至0.1 mg)，置于5 ml离心管中，加入丙酮20 ml，超声波(功率600 W，频率25 kHz)萃取5 min，以8 000 r/min离心5 min，收集上清液；残渣再加入丙酮20 ml，超声波二次萃取，合并萃取液于鸡心瓶中，旋转蒸发至约3 ml，采用PSA柱净化，用丙酮清洗鸡心瓶3次后过PSA柱，净化液旋转蒸发至近干，用丙酮定容至1 ml，用0.22 μm有机系滤膜过滤，滤液供GC-MS/MS测定。

2.4 标准曲线的绘制

分别移取适量的OPP混合标准溶液，用丙酮稀释配制成质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5及1.0 μg/ml的系列混合标准工作溶液，按“2.2”项下GC-MS/MS条件进行测定，以OPP质量浓度为横坐标(x)，以OPP峰面积为纵坐标(y)，绘制标准工作曲线。

表2 10种OPP化合物GC-MS/MS MRM模式下检测参数Tab 2 Detection parameters of 10 kinds of OPP compounds in GC-MS/MS multi-reaction monitoring mode

2.5 中草药风险评估

依据《中国不同人群消费膳食分组食谱》，结合OPP残留化学评估推荐的规范残留试验中值和已制定的最大残留限量(MRLs)计算OPP在白花蛇舌草、茅根和臭花的国家估算每日摄入量(NEDI)和风险商(RQ)。(1)NEDI(mg)=Σ(STMRi×Ei×Pi×Fi)。其中，Fi=0.091 5，为我国一般人群对中草药的日摄入量，单位为kg；STMRi为规范残留试验中值，单位为mg/kg；Ei和Pi分别为可食部分因子和中草药加工因子，本研究中不考虑区别，均设为1。(2)RQ=NEDI/(ADI×bw)。其中，ADI为每日允许摄入量，参照国家相关标准，单位为mg/kg；bw为体重，单位为kg，我国人均体重一般以63 kg计。RQ<1时，表示风险为可接受，数值越小，风险越小；RQ>1时，表示存在不可接受的风险，数值越大，风险越大[21]。

3 结果

3.1 质谱条件的优化

在正离子模式下，对10种OPP在m/z50～500范围内进行全扫描，得到总离子流色谱图，确定各OPP的保留时间，选择丰度较高且质荷比较大的特征离子为母离子；采用子离子扫描，优化碰撞能量，选择丰度较高且干扰较小的两对特征离子作为定量离子和定性离子[12]，优化后的10种OPP质谱条件见表2，其MRM色谱图见图1。

A.HP-5MS；B.DB-Wax ms；CDB-1701A.HP-5MS；B.DB-Wax ms；CDB-1701图1 不同色谱柱对10种OPP的总离子流色谱图(序号对应名称见表1)Fig 1 Total ion chromatogram of 10 kinds of OPP by using different kinds of chromatographic columns (the number codes are consistent with those in Tab 1)

3.2 色谱条件的优化

分析了同规格(30 m×0.25 mm×0.25 μm)不同固定性填料的HP-5MS、DB-Wax ms和DB-1701等毛细管色谱柱对10种OPP的色谱分离效果，结果见图1。从图1中可知，DB-Wax和DB-1701毛细管色谱柱不能同时实现10种OPP完全分离，而10种OPP在HP-5MS色谱柱上可分离完全，色谱峰响应值较高，且峰形尖锐对称。因此，分析柱选择HP-5MS。

3.3 提取溶剂的选择

根据相似相溶原理，对比了正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、乙腈及甲醇等不同有机溶剂对白花蛇舌草、茅根和臭花等中草药中10种OPP提取率的影响。结果显示，对10种OPP的平均提取回收率由高至低依次为：乙腈(95.9%)>丙酮(95.2%)>乙酸乙酯(91.1%)>二氯甲烷(89.4%)>正己烷(83.7%)>甲醇(79.8%)，其中乙腈对10种OPP的提取回收率最高，但经GC-MS/MS分析，乙腈提取液中杂质峰基质干扰较大，而丙酮萃取液中杂质峰较少，故提取溶剂选择丙酮。

3.4 净化柱的选择

白花蛇舌草、茅根和臭花等中草药中含有黄酮类、生物碱、醌类、香豆素和木脂素类、皂苷类、有机酸类以及挥发油等成分，对比了PSA柱、NH2柱、CARB柱和氟罗里硅土柱等净化柱对10种OPP净化回收效果的影响，结果见表3。从表3中可知，PSA柱可有效去除白花蛇舌草、茅根和臭花等中草药中基质干扰物质，10种OPP的平均净化回收率高达97.2%，故净化柱选择PSA柱。

表3 不同净化柱对10种OPP平均净化回收率的影响(序号对应名称见表1)Tab 3 Effects of different purification columns on average purification recovery rate of 10 kinds of OPP(the number codes are consistent with those in Tab 1)

3.5 基质效应的影响

为分析白花蛇舌草、茅根和臭花样品基质对GC-MS/MS法测定10种OPPs萃取效率的影响，采用标准加入法，在色谱纯丙酮溶剂、不含目标物的实际白花蛇舌草、茅根和臭花等不同基质中分别加入0.01 mg/kg 10种OPPs计算基质效应(Me=A/B×100%，其中A为不含目标物的实际样品中OPPs质谱响应值，B为色谱纯丙酮溶剂中OPPs质谱响应值)。试验结果表明，经GC-MS/MS测定，在色谱纯丙酮溶剂、不含目标物的实际白花蛇舌草、茅根和臭花四种不同基质中10种OPPs基质效应Me值在92.4%～100.3%(见表4)，即白花蛇舌草、茅根和臭花三种基质对10种OPPs的分析过程中没有显著的干扰，没有基质效应。

表4 10种OPP在3种中草药中的基质效应Tab 4 Matrix effect of 10 kinds of OPP in 3 kinds of Chinese herbal medicine

3.6 线性关系、检出限和定量限

10种OPP质量浓度在0.01～1.0 μg/ml范围内，OPP质量浓度与其峰面积之间呈良好线性关系，相关系数(r2)为0.999 3～0.999 7。以信噪比(S/N)=3计算，10种OPP的检出限(LOD)为1.0～3.0 μg/kg；以信噪比(S/N)=10计算，10种OPP的定量限(LOQ)为3.3～10.0 μg/kg，见表5。

3.7 精密度和回收率

在不含目标物的实际白花蛇舌草、茅根和臭花样品中分别加入0.01、0.5及1.0 mg/kg 3种不同水平的10种OPP标准

表5 10种OPP的线性范围、检出限和定量限Tab 5 Linear range, limit of detection and limit of quantification for 10 kinds of OPP

溶液，按本研究所建立的GC-MS/MS法测定10种OPP的加标回收率及方法精密度，结果见表6。从表6中可知，在0.01～1.0 mg/kg加标浓度范围内，10种OPP的加标回收率为90.3%～98.8%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～3.4%。

3.8 实际样品中OPP残留水平和中草药风险评估

采用本研究所建立的GC-MS/MS法对潮汕地区随机采样的白花蛇舌草、茅根和臭花(各10份)中10种OPP残留水平和组成特征进行分析和中草药风险评估。结果表明，经中国农药信息网查询，对硫磷、乙酰甲胺磷及甲基对硫磷等10种OPP为已被国家明令禁止使用的农药，且不得在蔬菜、果树、茶叶和中草药材上使用；经GC-MS/MS法对潮汕地区随机采样的白花蛇舌草、茅根和臭花中10种OPP残留量测定，白花蛇舌草、茅根和臭花中，10种OPP均未检出，可能是由于在上述3种中草药的种植过程中均未使用这10种OPP，从而不会对普通人群造成不可接受的长期膳食摄入风险，使用安全性较高。

4 讨论

本研究采用QuEChERS法处理潮汕地区常用中草药白花蛇舌草、茅根和臭花，以GC-MS/MS为分析检测手段，建立10种OPP的选择性多残留检测方法，分析不同中草药中OPP总体残留水平、分布特征，并对其OPP残留进行风险评估。结果显示，10种OPP质量浓度在0.01～1.0 μg/ml范围内，OPP质量浓度与其峰面积之间呈良好线性关系，相关系数(r2)为0.999 3～0.999 7；检出限为1.0～3.0 μg/kg，定量限为3.3～10.0 μg/kg；加标回收率为90.3%～98.8%，相对标准偏差为1.2%～3.4%；潮汕地区随机采样的白花蛇舌草、茅根和臭花中，10种OPP均未检出残留，不会对普通人群造成不可接受的长期膳食摄入风险。

表6 10种OPP的加标回收率和精密度(n=6)Tab 6 Recovery and precision of 10 kinds of OPP (n=6)