茶皂素提取纯化技术及生物活性研究进展

杜金婷，李 雁，张 雁，骆碧群，林 江，王佳佳，廖 娜

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；3.广东星汇生物科技有限公司，广东 龙川 517323）

茶皂素又名茶皂甙，是一类齐墩果烷型五环三萜类皂甙混合物，也是良好的天然表面活性剂和小分子生物活性物质，广泛存在于山茶科、山茶属植物的根、茎、叶、花、果、籽中，尤其以茶籽中含量最多［1-2］。油茶是世界四大木本油料植物之一，其中的茶籽富含茶皂素，被认为是一种宝贵的自然资源，且因其经济和环境效益较高而越来越受到关注。油茶是我国特有的油料树种，在华南地区广泛种植，每年可产出260 多万t 油茶籽，经榨油后可产生约140 多万t 油茶粕。但受提取纯化技术的限制，市场流通的茶皂素纯度较低，致使现有的产业价值低于其实际商品价值。

目前，茶皂素的主要提取方法为水提法、有机溶剂法等传统方法，然而传统方法提取时间长、纯度低，无法满足食品医药等行业的要求。近年来出现了新兴的辅助提取法，如微波提取法、超声提取法等，在提高产品纯度的同时可缩短提取时间，提高提取效率，但因成本高和初期投资较大而难以大规模应用。由此可见，为提升茶皂素行业经济价值，寻找简单高效的提取纯化技术显得尤为重要。

茶皂素具有发泡、乳化、分散等表面活性作用，还有抗菌、胃肠保护、抗癌、降血脂等生物活性［3-5］，在医药、农业、工业和环境保护等领域具有广阔应用前景。茶皂素是一类混合物，目前国内对茶皂素生物活性的研究多停留在皂苷混合物层面上，并未对其中已报道的77 个单体茶皂苷的生物活性进行研究。此外，在进行生物活性研究上，缺乏对作用机理和构效关系的研究，因此限制了茶皂素在生物医药等行业的运用。此外，目前国内外对茶皂素的研究仅在少部分茶树种类中开展，对未开发或者较少研究的茶树种类中的茶皂素生物活性、构效关系和作用机理研究较少，这将是未来研究的重要方向。

本文对茶皂素的提取纯化技术及生物活性进行综述，以期为新型提取纯化方法的开发提供理论参考依据，同时为茶皂素开发和油茶粕的综合利用提供基础。

1 茶皂素的理化性质和结构

纯茶皂素为乳白色或淡黄色无定形粉末，是一种非离子型表面活性剂，平均分子式为C57H90O26，相对分子质量在1200～2800，熔点为224℃，pH 值为5.0～6.5，表面张力为47～59 N/m［6］。茶皂素吸湿性强，有强起泡能力；极性较大，易溶于含水甲醇、含水乙醇，以及冰醋酸、醋酐、吡啶等，难溶于无水甲醇、乙醇，不溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚等有机溶剂；茶皂素能与醋酸铅、氢氧化钡等反应析出沉淀物［7］。茶皂素由于在C-21 位上连α、β 不饱和共扼双键，因此在215 nm 波长处对紫外光有最大吸收峰，可作为茶皂素的特征吸收峰用于结构鉴定。此外，茶皂素能够与香草醛-硫酸进行显色反应，在545 nm波长处有特征吸收峰，由此可以对其进行定量测定［8］。

茶皂素由疏水性配基、亲水性糖体和有机酸三部分组成，其配基是β-香树素衍生物，目前从茶籽中分离鉴定出7 种皂苷配基，这7 种配基的区别在于A 环上C-23、C-24 及E 环上C-21的连接基团不同。茶皂素结构中的糖体主要包括葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖与半乳糖，与配基环上的羟基以甙键式相结合。有机酸主要由当归酸、惕各酸、醋酸和肉桂酸组成，茶皂素配基与有机酸的结合形式是配基环上的羟基与有机酸结合成酯。研究表明，茶树品种及其生长环境会影响茶皂素的种类，即使同一棵茶树不同部位其结构都会有较大差异［9］，这与配基和糖体相关联，而造成如此差异主要是由于茶皂素C-3、C-4、C-16、C-16、C-21、C-22、C-23、C-28 位上取代基的多样性。

2 茶皂素提取技术

茶皂素是茶籽中的重要生物活性成分，1931年青山次郎开始开展茶皂素研究，但由于其结构复杂性导致茶皂素提取困难［10］。传统提取方法有水提法和有机溶剂法，近年来辅助提取法、闪式提取法、生物提取法和双水相提取法等新方法也备受关注。

2.1 微波辅助提取法

微波辅助提取是通过离子传导和偶极旋转直接作用于植物分子，使能量在样品和溶剂中快速传递，然后产生分子运动和热促使物质分离［11］。表1 列举了近年来采用微波辅助提取茶皂素的研究结果。He 等［12］对比了微波辅助提取与常规提取茶皂素的提取效果，发现微波辅助提取法将提取时间从6 h 降低到4 min，且节省约50%乙醇使用量。微波辅助法能够有效提升提取效率，但由于初期设备投资高和生产过程辐射较大，目前仍处于实验室阶段，未来可通过结合连续多级逆流等提取工艺以应用于工业大生产［15］。

2.2 超声波辅助提取法

超声波作用于液体可使液体内产生空化效应，强大的压力使得细胞壁破裂，同时超声波产生的振动可加速胞内物质释放、扩散和溶解，有效提高物质提取速率并保持生物活性不变［16］。表2 列举了近年来采用超声波辅助提取茶皂素的研究结果。超声波与传统提取技术结合提取茶皂素能大幅缩短提取时间，降低能耗，且茶皂素产品纯度高、质量好。但超声波的强大作用力也造成杂质溶出，从而对产品后期纯化造成影响，此外超声波的使用会使人体出现不适反应，这限制了其大规模应用［7］。

表1 微波辅助提取茶皂素工艺对比Table 1 Comparison of microwave-assisted extraction processes of tea saponin

表2 超声波辅助提取茶皂素工艺对比Table 2 Comparison of ultrasonic-assisted extraction processes of tea saponin

2.3 超临界萃取法

超临界萃取是天然产物萃取领域的关键技术之一，在超临界状态下，将超临界流体与待分离物质接触，使其选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来，然后借助减压、升温的方式使其变成普通气体，从而达到分离提纯的目的。伊文峰［20］采用乙醇为动态夹带剂超临界萃取茶皂素，得率为14.9%。吕晓玲等［21］利用CO2进行超临界萃取茶皂素，在最佳萃取条件下收率为15.23%，纯度达到78.65%，与乙醇浸提法相比，纯度提高54%。超临界萃取法具有效率高、工艺简单和产品质量稳定等优点，但其设备昂贵和生产成本高等因素限制了其广泛利用。

2.4 闪式提取法

闪式提取是在室温和适当溶剂条件下，利用高速剪切力和搅拌力将植物原料粉碎至细微颗粒，并在局部负压渗透作用下使有效成分迅速达到溶解平衡［22］。朱兴一等［23］利用闪式提取器提取茶皂素，得率为21.09%，与传统热回流提取法相比，提取时间由6 h 缩短为40 s，提取温度由70 ℃降到20～25 ℃。可见，闪式提取法有省时、溶剂消耗小和保护热敏感成分等优点，但其单次处理量少且灵活处理能力较低［24］。

2.5 生物提取法

生物提取法包括酶解法和发酵法，酶解法是通过生物酶作用，使物质酶解从而分离出茶皂素［25］。目前较为常用的生物酶有综合脂肪酶、纤维素酶和蛋白酶。张云丰等［26］利用酶解法提取茶皂素，提取率为86.86%。发酵法是通过接入酒精酵母对茶籽中丰富的糖类和蛋白质进行发酵［7］。王文杰等［27］利用酒精酵母进行二次发酵，结果茶皂素纯度达到62.37%，且提取率为常规提取的5 倍以上。可见，生物提取法具有能耗低、提取效率高等优点，但温度控制要求较高且可溶性杂质较多，因此目前在工业上的应用还较少。

2.6 亚临界水提法

亚临界水提取技术（Subcritical water extraction,SWE）是以亚临界水为溶剂，通过改变水的介电常数，加快扩散速率，降低表面张力和黏度，达到提取极性或非极性溶质的一种新型技术［28］，被广泛应用于中药、植物、食品中生物活性物质提取。目前，已有利用SWE 提取多种天然活性成分的报道。Wu 等［29］利用SWE 提取茶皂素，在提取时间为30 min 的条件下，茶皂素提取率为74.21%。与此相似的是，李振海等［30］进行32 min 的亚临界水提后，茶皂素提取率达到72.20%。可见，SWE 具有提取率高、耗时短、无有机溶剂残留、环境友好等优点［31］，是一种极具潜力的绿色提取技术，在植物有效成分提取领域具有广阔前景。

2.7 双水相提取法

近年来，双水相提取法（Aqueous two-phase extraction，ATPE）逐渐应用于小分子的提取和纯化，其集提取纯化于一体，可有效提升天然活性物质粗提物的提取率。目前，为提高提取效率，ATPE 多与超声波和微波等辅助方法结合。Lin等［32］利用微波辅助双水相提取香菇多糖，其提取率为11.16%，高于热回流提取法的9.89%和超声提取法的9.76%，同时该法大大提高提取效率且能选择性提取各种多糖。可见，ATPE 法具有萃取选择性好、环保、易规模化以及成本低等优点，是一种极具潜力的新型提取方法。目前，尚未有ATPE 应用于茶皂素提取的研究报道。

3 茶皂素分离纯化方法

茶皂素可应用于多种领域，但目前市售的茶皂素产品杂质较多，需要纯化后应用。目前常用的纯化方法有酶解法、沉淀法、大孔树脂法、凝胶色谱法、膜分离法等。

3.1 酶解法

酶解法是通过用选择性高的生物酶对与茶皂素相互作用较强的多糖和蛋白质杂质进行水解去除，最终得到高纯度茶皂素的一种纯化方法。游瑞金等［33］采用生物酶-沉淀法纯化茶皂素，通过工艺优化，得到最佳工艺条件，在组合酶（纤维素酶与糖化酶的比例为1 ∶2）用量为0.5%的条件下，可将茶皂素纯度由67.5%提高到98.3%。周红宇等［34］利用壳聚糖-蛋白酶联用方法分离纯化茶皂素，结果显示，经过蛋白酶处理后，粗茶皂素中蛋白质去除率高达70%以上，且壳聚糖絮凝时茶皂素损失率显著降低。酶具有专一性和高效性，因此采用酶解法的产品纯度高和酶用量少，且对环境友好，但所需反应时间较长，在工业运用上仍需进一步研究。

3.2 沉淀法

沉淀法是通过加入沉淀剂，使茶皂素或杂质沉淀，而另一部分则留在提取液中，从而使得茶皂素与杂质分离。沉淀法所用的沉淀剂可分为两类，一类是将茶皂素沉淀下来，包括有机溶剂沉淀剂（CHCl3、CH3COCH3、石油醚等）和金属离子沉淀剂（钙、铅、铜、钡等离子）；另一类是将杂质沉淀下来，主要有壳聚糖、KAl（SO4）2、PAC、PAM 以及 C2H5OH 等［35］。赵娟等［36］利用蛋白质、单宁等杂质不溶于丙酮的性质，采用丙酮为沉淀剂对茶皂素进行纯化，产品纯度从54.8%提高到87.20%。此外，王金元等［37］探究了壳聚糖和氧化钙联合沉淀的效果，纯度有较大提升，但由于加入絮凝剂导致茶皂素损失率增加。沉淀法可选择性沉淀杂质或所需成分，具有工艺简单和易操作等优点，可适用于工业化大生产。但由于某些沉淀剂具有一定毒性，使得该法应用范围受到限制。

3.3 凝胶色谱法

凝胶色谱法是利用分子筛原理分离不同分子量的化合物，再用不同浓度的洗脱剂洗脱，致使各成分按分子量递减的顺序依次被洗脱下来。姜伟等［38］采用Sephadex LH20 纯化油茶饼粕乙醇提取物，得到纯度为95.58%的油茶皂素。该法操作简单、分离效果较好，但目前因其成本过高而难以在工业上推行。

3.4 高速逆流色谱法

高速逆流色谱（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一种具有独特优势的液相分配色谱技术，近年来在天然活性成分分离纯化领域发展迅速。吴佩娟等［39］利用未成熟罗汉果为原料，应用高速逆流色谱从总皂苷中分离罗汉果皂苷单体，在氯仿-甲醇-正丁醇-水（5∶6∶1∶4，V/V/V/V）的溶剂体系下，一次性制备4个化合物，纯度分别为95.5%、98.2%、80.1%和97.6%。该方法具有操作简单、样品回收率高、损失少、避免样品失活等优点，但成本较高，因此目前在工业上推广应用仍需作进一步研究。

3.5 大孔树脂法

大孔树脂是一类聚合物吸附剂，目前应用大孔树脂纯化茶皂素的报道逐年增多（表3）。大孔树脂具有吸附选择性强、富集效果好及再生简便等优点，被广泛应用于天然产物分离纯化。大孔树脂法能显著提升茶皂素纯度，但也存在原料预处理难度大、提纯后产品有机残留高、树脂使用寿命短等问题。因此，目前该技术在批量化生产上还不够成熟［43］，工业化生产仍需完善。

表3 大孔树脂纯化茶皂素的工艺对比Table 3 Comparison of macroporous resin purification processes of tea saponin

3.6 膜分离法

膜分离技术是指不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离的技术。膜分离技术中，根据膜孔径大小可以实现不同程度的分离、纯化，具体可分为微滤、超滤、纳滤、反渗透、气体分离、电渗析等［44］。顾姣等［45］利用10 ku改良纤维素复合膜对茶皂素进行分离提纯，茶皂素纯度可达84.16%。程轶群等［46］在0.05 µm 孔径、0.1 MPa 压力和1%料液质量分数下纯化茶皂素，产品纯度由50%提高到83%。近年来，纯化技术联合使用成为了新的研究方向，例如，微滤-超滤组合工艺、膜分离与大孔树脂结合等。孟维等［47］采用微滤-超滤组合工艺对纯度为70%左右的粗茶皂素水溶液进行精制，经过优化，茶皂素纯度提高到91.8%。综上所述，膜分离具有低能耗、效率高、条件温和及易操作等优点，但在操作过程中，膜会出现堵塞、污染和过滤速度慢等问题，解决这些问题将是膜分离走向工业化的关键节点。

4 茶皂素的生物活性

4.1 抗菌活性

茶皂素在体外、体内均具有抗菌作用，对细菌、真菌均具有良好的抗菌活性。目前，由于抗生素耐药性，使新型抗细菌化合物的需求日益增长，其中以植物抗菌活性成分最受关注。Hu 等［48］从油茶饼粕中提取茶皂素，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等细菌均具有良好的抑菌活性，MIC 值为31.3～62.5 µg/mL，而且茶皂素对革兰氏阴性菌的抑制活性高于革兰氏阴性菌，其认为原因可能是茶皂素与革兰氏阴性菌的菌膜脂多糖结合，从而达到更好的抑制效果。此外，除了常见的细菌，茶皂素对鱼类细菌也有显著抗菌活性，Boran 等［49］研究发现，茶皂素作为膳食补充剂可抑制5 种虹鳟鱼细菌病，提高鱼存活率。进一步研究表明，茶皂素在体内体外的抗菌机理不同，其通过溶菌酶活性增强免疫功能以提高体内抗菌活性；而通过促进细菌裂解，抑制细菌粘附和增加细胞壁通透性以提高体外抗菌活性［48-49］。茶皂素是具有潜力的天然抗菌剂，为提高抗菌效果和安全性，需根据目标微生物确定对应的茶皂素单体，这仍需作进一步深入研究。

茶皂素具有广谱和高抗真菌活性。近年来，关于茶皂素对植物致死型真菌报道逐渐增多，黄继光等［50］测定12 种植物病原菌抑菌活性发现，茶皂素对稻瘟病菌、柑橘青霉病菌、番茄小核病菌、荔枝霜疫霉、玉米小斑病菌5 种病原菌菌丝生长有显著抑制作用，其中稻瘟病菌和柑橘青霉病菌的EC50值为20.15、11.39 μg/mL。此外，茶皂素还具有良好的人工杀菌剂增效作用，其与代森锰锌作用于辣椒炭疽病菌［51］，与甲霜灵混配作用于黄瓜疫病菌［52］的试验结果均证实其增效作用，另有研究发现联合用药时MIC 为单独用药的1/4～1/32，可大幅度降低抗菌药物使用量。由此可见，充分利用茶皂素的抗菌活性，研发绿色环保抗菌剂或实行联合用药对化学农药减量化和绿色除菌具有重大意义。

4.2 溶血活性和毒性

茶皂素具有溶血活性，富含茶皂素的油茶粕可用于生产动物饲料，为减少过量茶皂素等抗营养因子的不良作用，脱毒成为必要步骤。Qian 等［53］研究发现，固态发酵可降低溶血活性，进一步研究表明，茶皂素溶血作用与苷元类型和糖侧链有关，通常情况下糖链越长、毒性越大［54］。茶皂素具有鱼毒作用，这种作用主要是因为茶皂素通过破坏鱼鳃的上皮细胞进入鳃血管和心脏，使红细胞产生溶血；也可能是由于鱼虾携氧载体的差异［55］。陆剑锋等［56］发现茶皂素制剂浓度为2.5 mg/L 时，24 h 内即可将实验鱼全部杀死；但即使茶皂素浓度高达50 mg/L 时，南美白对虾、河蟹48 h 的存活率分别可达100%和90%以上。因此，茶皂素可作为清塘剂应用于水产品养殖，实现“清鱼护虾”的目的。

4.3 促进植物吸收污染物

近年来，土壤污染日益严重，利用植物修复的新型修复方法因成本低廉，较传统修复便宜2～10 倍而快速发展，但修复效率低却阻碍其大规模使用。研究表明，茶皂素可去除污染物也可促进植物吸收污染物。多环芳烃和重金属是最主要的土壤污染源，Song 等［57］发现茶皂素对重金属和多环芳烃具有良好去除作用，对污染土壤中菲和镉去除率分别为87.7%和76.2%。在土壤中添加0.01%茶皂素后，玉米幼苗根中多氯联苯（PCB14、18、77 和156）浓度是未经处理的2～3倍［58］。因此，利用茶皂素联合净化是一种极具前景的修复污染土壤的技术。

4.4 其他生物活性

茶皂素还具有胃肠保护、抗癌、降脂减肥等生物活性。近年来，众多学者发现茶皂素可通过抑制胃粘膜损伤和抑制胃排空并加速胃肠道蠕动的方式保护肠胃。研究发现，多种茶皂素对乙醇或吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤具有保护作用，在5.0 mg/kg 剂量下对胃粘膜损伤具有抑制作用，其中茶皂素E1 和E2 的抑制率为71.45%和77.6%，这种抑制效果强于临床药物奥美拉唑和盐酸西曲辛［59］。此外，茶皂素还有良好的抗癌活性，其抗癌途径主要包括诱导细胞凋亡和细胞周期停滞、抗血管生成和抑制奎宁氧化还原酶（QR）。Chen 等［4］发现油茶茶皂素对人乳腺癌细胞MCF-7 的细胞有显著抑制效果，当浓度为30 µmol/L 时，抑制率超过80%。因此，充分利用茶皂素抗癌生物活性开发新型抗肿瘤药物显得十分重要。茶皂素能改善血液流变异常，调节血脂代谢，是良好的降血脂潜在药物。Ye 等［60］研究表明，口服油茶皂素（50、100 mg/kg BW）可以降低总胆固醇、总甘油三酸酯和低密度脂蛋白水平，增加高密度脂蛋白含量，且有效性与阳性药物辛伐他汀（4 mg/kg BW）相似。可见，茶皂素良好的生物活性物质对医药、食品以及化工领域都有积极作用。

5 展望

近年来，关于茶皂素的研究越来越多，且越来越深入。茶皂素提取和分离纯化方法很多，各有其优势，也有其局限性。传统提取技术成本低，而新兴提取技术效率高且产品纯度高，但因成本过大而无法应用于工业大生产。因此，联合使用传统与新兴提取纯化方法提高纯度和降低成本成为新的研究方向。

茶皂素具有抗菌、可调节胃肠系统、抗癌、降血脂等多种生物活性，基于其良好的抗菌活性，可研发绿色环保抗菌剂，实现绿色除菌的目的；基于其促进植物吸收污染物的活性，可作为土壤净化剂，修复土壤污染；基于其肠胃保护、抗癌、降血脂和减肥等活性，可研制安全高效的合成替代药物，为人类疾病预防和治疗带来新希望。尽管茶皂素是一种极具潜力的天然药物，但目前研究尚停留在动物实验阶段且对其准确抗病机理仍不清楚，这也将是今后研究的重点。此外，茶皂素研究仅在少部分茶树种类中开展，未来需要更加关注到未开发或者较少研究的茶树种类中茶皂素的生物活性、构效关系和作用机理的研究。